阻断RAAS不同环节对肝纤维化大鼠ACE2、AngⅡ、Ang 1-7的影响

张晓梅，焦占江，殷鹏，丁国善，周杰，崔忠林，钱建平，曾德华(第二军医大学长征医院器官移植研究所，上海0000;南方医科大学南方医院; 南京军区福州总医院)

阻断RAAS不同环节对肝纤维化大鼠ACE2、AngⅡ、Ang 1-7的影响

张晓梅1，焦占江2，殷鹏1，丁国善1，周杰2，崔忠林2，钱建平2，曾德华3
(1第二军医大学长征医院器官移植研究所，上海200003;2南方医科大学南方医院; 3南京军区福州总医院)

摘要:目的观察阻断肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS)不同环节对实验性肝纤维化大鼠肝组织纤维化程度的影响并探讨其作用机制。方法取6周龄SD大鼠50只，随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组和螺内酯组各10只。正常对照组皮下注射橄榄油，其他组给予40% CCL4腹壁皮下注射制备肝纤维化模型;自次日起，卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组分别经胃管内灌注ACE抑制剂卡托普利、血管紧张素(Ang)Ⅱ的Ⅰ型受体阻断剂氯沙坦、醛固酮受体拮抗剂螺内酯，模型组和正常对照组灌注等量生理盐水。各组动物均于第8周处死，取肝组织行HE染色和Masson染色，观察其病理变化。ELISA法测定血清与肝组织中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7。结果卡托普利组、氯沙坦组和螺内酯组肝纤维化程度较模型组明显好转;模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组的血清及肝组织中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平均高于正常对照组，卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组的ACE2及Ang 1-7水平均高于模型组、AngⅡ水平低于模型组(P均＜0.05) ;氯沙坦组、螺内酯组的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平与卡托普利组相比差异无统计学意义。结论阻断RAAS不同环节均可抑制肝纤维化形成，其机制可能是通过升高血清及肝组织中ACE2、Ang 1-7水平、降低AngⅡ水平来发挥抗肝纤维化的作用。

关键词:肾素—血管紧张素—醛固酮系统;肝纤维化;血管紧张素Ⅱ;血管紧张素1-7

肝纤维化是诸多肝病共同的病理改变。肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS)为一内分泌系统，具有广泛的生物学效应，作用于全身多个器官。除了循环系统中存在RAAS，许多器官如心、肾、肺、胰腺和肝脏都存在局部或器官内的RAAS［1］。研究表明，肝脏局部的RAAS参与肝纤维化的发展［2］。2012～2015年，我们对肝纤维化大鼠模型胃管灌注血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂卡托普利、血管紧张素(Ang)Ⅱ的Ⅰ型受体阻断剂氯沙坦、醛固酮受体拮抗剂螺内酯，观察其对血清及肝组织中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平的影响，探讨阻断RAAS不同环节抗肝纤维化的实验依据。

1　材料与方法

1.1材料6周龄清洁级SD大鼠(福建医科大学动物实验中心提供) 50只，雌雄不拘，体质量180～220 g，室温18～25℃，湿度30%～50%，精制饲料喂养。氯沙坦钾片(杭州默沙东制药有限公司)，卡托普利片(湖南湘雅制药有限公司)，螺内酯片(杭州民生药业集团有限公司产品)。ACE2、AngⅡ、Ang 1-7酶联免疫测定试剂盒均购自美国mybiosource公司。

1.2分组与给药方法将大鼠随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组、螺内酯组和氯沙坦组，每组各10只。正常对照组皮下注射橄榄油，余均予以40% CCL4腹壁皮下注射，3 mL/kg，首剂加倍，1次/3 d，复制大鼠肝纤维化模型;次日起，卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组胃管内分别灌注卡托普利60 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、螺内酯100 mg/kg，模型组和正常对照组灌注等量生理盐水，均1次/d。各组动物均于第8周处死，取肝脏相同部位的组织，液氮保存，且在大鼠处死前于大鼠尾静脉取血。

1.3观察指标①一般情况:观察大鼠体质量、精神、饮食、活动、死亡等情况。②肝组织病理检查及纤维化评分:肝脏组织染色后在光镜下观察其病理变化。参照肝纤维化半定量计分系统(SSS)对大鼠肝纤维化进行评分［3］。对大鼠肝组织切片进行Masson染色，每张切片选取四周及中央区域胶原纤维含量最多的视野，采集图像后应用HIPAS-2000型计算机图像分析系统进行图像处理，计算着色面积和总面积，于100倍镜下测定胶原纤维面积，以胶原纤维面积/肝组织面积×100%计算胶原纤维面积百分比。③血清及肝组织中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7检测:采用ELISA法测定，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。取出冻存血清及肝组织匀浆后的上清液，室温溶解。严格按照说明书配制标准品，逐一梯度稀释，最后的一管作为空白对照，加入标准品和待测样品，均设复孔，每孔100 μL，震荡混匀。37℃反应120 min。洗涤，依次加入一抗、酶标抗体、底物工作液100 μL，混合均匀，37℃反应30 min。加入终止液100 μL终止反应。用酶标仪在450 nm处测定吸光度(OD)值。计算浓度:所有OD值减去空白值后再计算，以标准品为横坐标，对应的OD值为纵坐标，画出标准曲线，根据所测样品对应的OD值，在标准曲线上查出相应的浓度(样本被稀释后的，还应乘以稀释的倍数)。

1.4统计学方法采用SPSS11.0统计软件，计量资料以珋x±s表示，多组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组一般情况各组均无大鼠死亡。正常对照组精神良好，毛色光泽，运动活泼，反应敏锐，进食、饮水正常，体质量增加;模型组精神萎靡，活动少，反应迟钝，进食、饮水少，体质量下降明显;卡托普利组、螺内酯组和氯沙坦组精神、活动、反应、饮食、体质量均较模型组好。

2.2各组肝组织病理检查结果HE染色显示，正常组肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列，结构完整。模型组肝细胞索排列紊乱，肝细胞呈弥漫性脂肪变性，空泡形成，汇管区扩大，汇管区和肝小叶内可见淋巴细胞浸润，假小叶形成。卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组见肝细胞坏死及空泡变性减少，淋巴细胞浸润减少。Masson染色可见正常组胶原纤维在血管周围少量表达，模型组胶原纤维增生明显，纤维间隔形成，可见弓形纤维，部分区域形成假小叶，卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组胶原纤维减少，形成的纤维间隔和假小叶明显减少。

2.3各组肝纤维化SSS评分正常对照组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组肝纤维化评分分别为(0.53±0.15)、(7.05±0.26)、(7.15±0.11)、(6.68±0.31)分，均低于模型组的(19.40±0.87)分(P均＜0.05)，卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组均高于正常对照组(P均＜0.05)，氯沙坦组、螺内酯组、卡托普利组间比较差异无统计学意义。

2.4各组胶原纤维面积百分比正常对照组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组胶原纤维面积百分比分别为(0.71±0.04) %、(9.95±0.57) %、(11.18± 0.62) %、(11.53±0.55) %，均低于模型组的(23.70 ±1.87) %，P均＜0.05，卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组均高于正常对照组(P均＜0.05)，氯沙坦组、螺内酯组与卡托普利组比较差异无统计学意义。

2.5各组血清及肝组织中ACE2、AngⅡ和Ang 1-7水平见表1。

表1　各组血清及肝组织中ACE2、AngⅡ和Ang 1-7水平比较(ng/mL，±s)

注:与正常对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05。

组别　n ACE2血清　肝组织Ang Ⅱ血清　肝组织Ang 1-7血清　肝组织正常对照组　10　6.30±0.24　7.30±0.30　0.10±0.01　0.23±0.03　0.11±0.01　0.30±0.02模型组　10　13.70±0.57*　14.90±0.48*　0.40±0.03*　0.76±0.03*　0.80±0.02*　0.89±0.02*卡托普利组　10　27.00±0.73＊△　23.30±0.79＊△　0.20±0.02＊△　0.40±0.02＊△　1.49±0.08＊△　1.57±0.28＊△氯沙坦组　10　28.50±1.23＊△　24.30±0.45＊△　0.17±0.02＊△　0.37±0.03＊△　1.32±0.02＊△　1.52±0.35＊△螺内酯组　10　28.40±1.03＊△　24.50±0.42＊△　0.16±0.01＊△　0.42±0.03＊△　1.35±0.03＊△　1.50±0.03＊△

3　讨论

肝纤维化是由于多种病因(如病毒、乙醇、寄生虫、铜铁沉积等)引起慢性肝损伤，最终导致以胶原为主的细胞外基质(ECM)各成分合成增多，降解相对不足，过多沉积在肝内，引起肝纤维化［4，5］。肝纤维化属可逆性病变，肝硬化则难以逆转。肝纤维化是肝细胞肝癌的危险因素之一［5］。

RAAS在慢性肝损伤、肝纤维化中起重要作用。除了循环系统中存在RAAS外，肝脏局部的RAAS也参与了肝纤维化的发展，并在肝纤维化的形成及发展过程中起重要作用。以往认为，RAAS作用轴ACE-AngⅡ-AT1受体轴是生物关联性的惟一体系，具有促进肝纤维形成的作用。ACE2-Ang 1-7-Mas受体轴是新发现的RAAS作用轴，对肝纤维化的发生具有保护作用［6］，被认为是ACE-AngⅡ-AT1受体轴的反向调节轴［7］。ACE2在RAAS中的作用与ACE相反，被认为是RAAS的一个负性拮抗剂。

ACE2是通过克隆技术从心衰患者和淋巴癌cDNA库中克隆出来的人类ACE相关羧肽酶［8，9］，定位于X染色体的Xp22位点。人类ACE2分子量约为120 kD，由805个氨基酸组成，是Ⅰ型膜结合糖蛋白，其结构包括一个由17个氨基酸组成的N末端信号肽区、一个锚定在细胞膜C末端的跨膜区和一个与ACE活性位点相一致的单一HExXH锌结合区。人与啮齿动物的ACE2是结构相似的蛋白质，小鼠与人的ACE2有83%的同源性，ACE与ACE2的金属蛋白酶催化区有42%是一致的［10］。ACE2被认为是慢性肝损伤的负调节剂［11］，对ACE具有拮抗作用。研究表明，RAAS的主要作用成分AngⅡ具有促纤维化的作用［12］，可诱导肝脏星形细胞收缩和增殖，这是肝腺泡纤维化的主要因素［10～14］。随着肝纤维化的进展，AngⅡ在肝脏中的表达逐渐增多［15］。研究表明，ACE裂解AngⅠ生成AngⅡ，ACE2可裂解AngⅠ和AngⅡ，分别生成Ang 1-9和Ang 1-7，而Ang 1-9可被ACE裂解，生成Ang 1-7。Ang 1-7对AngⅡ介导的肝脏纤维化具有保护作用［16］。研究证实，Ang 1-7能够减轻肝纤维化的程度，同时减少羟脯氨酸及胶原1A1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血管内皮生长因子(VEGH)、结缔组织生长因子(CTGF)、ACE及Mas受体的基因表达［17］。亦有研究表明，ACE2可裂解AngⅡ，增加Ang 1-7的生成，在胆管结扎肝纤维化大鼠中表现出抗肝纤维化的作用［18］。

本研究对循环中的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平进行检测，结果表明，模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平均高于正常对照组;卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组的ACE2及Ang 1-7水平均高于模型组、AngⅡ水平低于模型组;氯沙坦组、螺内酯组的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平与卡托普利组相比差异无统计学意义。提示循环中的ACE2、Ang 1-7、AngⅡ均参与了肝纤维化的形成和发展，肝纤维化形成及发展中ACE2、Ang 1-7、AngⅡ水平均升高，而采用ACE抑制剂卡托普利、AngⅡ受体阻滞剂氯沙坦、醛固酮受体拮抗剂螺内酯分别作用于RAAS的不同环节可以提高循环中ACE2、Ang 1-7水平，降低AngⅡ水平，从而起到抗肝纤维化的作用。

肝脏局部RAAS亦参与肝纤维化的形成及发

展。本研究对肝脏组织中的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平进行检测，结果表明，模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平亦均高于正常对照组;卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组的ACE2及Ang 1-7水平亦均高于模型组、AngⅡ水平低于模型组;氯沙坦组、螺内酯组的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平与卡托普利组相比差异无统计学意义。提示肝组织中的ACE2、Ang 1-7、AngⅡ均参与了肝纤维化的形成和发展，肝纤维化组织中，ACE2、Ang 1-7、AngⅡ水平均升高，采用ACE抑制剂卡托普利、AngⅡⅡ受体阻滞剂氯沙坦、醛固酮受体拮抗剂螺内酯分别作用于RAAS的不同环节可以提高肝组织中ACE2、Ang 1-7水平，降低AngⅡ水平，从而起到抗肝纤维化的作用。

综上所述，循环及肝脏组织中的AngⅡ在肝纤维化形成和发展中起着促肝纤维化发生发展的作用，而ACE2、Ang 1-7在肝纤维化形成和发展中具有重要的调控作用。干预RAAS不同的环节拮抗肝纤维化，可能是通过升高循环及肝脏组织中的ACE2、Ang 1-7、降低循环及肝脏组织中的AngⅡ来发挥抗肝纤维化的作用。

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Effects of local blockage of RAAS at different levels on expression of ACE2，AngⅡand Ang 1-7 in rats with hepatic fibrosis

ZHANG Xiao-mei1，JIAO Zhan-jiang，YIN Peng，DING Guo-shan，ZHOU Jie，CUI Zhong-lin，QIAN Jian-ping，ZENG De-hua
(1 PLA Institution of Organ Transplantation，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of local blockage of renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) on the degrees of fibrosis and to investigate its mechanism in liver tissues of experimental rats with hepatic fibrosis.Methods Fifty SD rats aged 6 weeks were randomly divided into five groups: the normal control group，model group，captopril group，losartan group and spironolactone group，with 10 rats in each group.In the normal control group，the rats received subcutaneous injection of olive oil，while other rats received subcutaneous injection of 40%CCL4to make the hepatic fibrosis models.The next day，rats of the three treatment groups were daily injected with captopril (captopril group)，losartan (losartan group) and spironolactone (spironolactone group).Rats in the control group and model group received the same amount of normal saline everyday.Rats in each group were sacrificed at 8 weeks.The liver tissues were obtained and stained by HE staining and Masson staining to observe the pathological changes.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the levels of ACE2，AngⅡand Ang 1-7 in the serum and liver tissues.Results The degree of liver fibrosis in the captopril group，losartan group and spironolactone group was significantly improved as compared with that of the model group; the levels of ACE2，AngⅡ，Ang 1-7 in the serum and liver tissue of the model group，captopril group，losartan group and spironolactone group were all higher than those of the normal control group; the levels of ACE2 and Ang 1-7 in the captopril group，losartan group and spironolactone group were all higher，but the AngⅡlevel was lower than that of the model group (all P＜0.05).No statistically significant differences were found in the levels ofbook=15,ebook=20ACE2，AngⅡ，and Ang 1-7 between the losartan group，spironolactone group and captopril group.ConclusionThe local blockage of RAAS at different levels may all inhibit the liver fibrosis，whose mechanism may be related with the increase of ACE2 and Ang 1-7 and the decrease of AngⅡin the serum and liver tissues.

Key words:renin-angiotensin-aldosterone system; liver fibrosis; angiotensinⅡ; angiotensin 1-7

(收稿日期:2015-01-28)

通信作者简介:焦占江(1981-)，男，主治医师。研究方向为肝纤维化的临床和基础研究E-mail: zhanjiangjiao@ yeah.net

作者简介:第一张晓梅(1984-)，女，住院医师。研究方向为肝移植及肝纤维化的临床及基础研究。E-mail: 910195473@ qq.com

基金项目:广东省自然科学基金资助项目(S2011010003901)。

文章编号:1002-266X(2015)18-0014-04

文献标志码:A

中图分类号:R575

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.005