2-羟丙基-β-环糊精对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响

戚勋，苑永辉，钟红珊，徐克(中国医科大学附属第一医院，辽宁省影像诊断与介入治疗重点实验室，沈阳000;辽宁省肿瘤医院)

2-羟丙基-β-环糊精对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响

戚勋1，苑永辉2，钟红珊1，徐克1
(1中国医科大学附属第一医院，辽宁省影像诊断与介入治疗重点实验室，沈阳110001;2辽宁省肿瘤医院)

摘要:目的探讨2-羟丙基-β-环糊精(2HP-β-CD)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外增殖和迁移的作用。方法体外培养HUVEC，分为两组，实验组分别加入浓度为10(－10)、10(－9)、10(－8)、10(－7)、10(－6)、10(－5)mol/L的2HP-β-CD，空白组加入含0.5% FBS的等量培养液。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活力，改良Boyden Chamber法检测各组细胞的迁移能力。结果实验组中，加入10(－10)、10(－9)、10(－8)mol/L 2HP-β-CD者的OD(450)分别为空白组的1.4、1.6、1.7倍，10(－8)mol/L 2HP-β-CD增强细胞增殖活力的作用最明显(P均＜0.01) ;加入10(－7)、10(－6)、10(－5)mol/L 2HP-β-CD者的OD(450)与空白组比较差异无统计学意义。加入10(－9)及10(－8)mol/L 2HP-β-CD者细胞迁移数显著高于空白组(P均＜0.05)，其他浓度组细胞迁移数与空白组比较差异均无统计学意义。结论适当浓度的2HP-β-CD可促进HUVEC的增殖和迁移。

关键词:2-羟丙基-β-环糊精;脐静脉内皮细胞;细胞迁移;细胞增殖;血管新生

治疗性血管新生是指将外源性血管新生诱导因子转入组织中，促进缺血区侧支毛细血管新生［1］，是近年来治疗局部缺血性疾病的重要方法［2］。血管新生过程与血管内皮细胞迁移和增殖密切相关［3］。环糊精(CD)是一类环状低聚糖，研究显示，β-CD可以刺激兔角膜血管新生［4］，而高浓度硫酸-β-环糊精具有抑制血管新生的作用［5］。关于2-羟丙基-β-环糊精(2HP-β-CD)对血管新生作用的报道少见。2014年6～12月，我们观察了2HP-β-CD对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的作用，旨在为治疗性血管新生提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料HUVEC购于南京凯基生物，解冻复苏后加入含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，置37℃、5% CO2培养箱内，待细胞融合至80%～90%状态后用于实验。2HP-β-CD、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、PBS及RPMI1640培养基购于美国Sigma-Aldrich公司，细胞增殖-毒性检测试剂盒购于日本Dojindo公司，青、链霉素和胰蛋白酶购于南京凯基生物，Diff-Quick染液购于北京Propbs公司，Boyden Chamber 及8 μm PVPF聚碳酸膜购于Neuroprobe。

1.2细胞增殖活力检测采用CCK-8法。取HUVEC细胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。按每孔1 500个接种于96孔板。培养24 h后弃培养液，加入含0.5% FBS的培养液预处理24 h，以达到细胞同步化。细胞分为实验组和空白组，实验组又分为6个浓度亚组，分别为N－10、N－9、N－8、N－7、N－6、N－5组，分别加入浓度为10－10、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol/L的2HP-β-CD，每组设6个复孔，按100 μL/孔加入含药培养液，空白组加入含0.5% FBS的等量培养液，继续培养48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，细胞培养箱内孵育4 h。使用酶标仪测波长450 nm处的OD值。

1.3细胞迁移能力检测采用改良Boyden Chamber法。将8 μm PVPF聚碳酸膜经10 μg/mL纤粘连蛋白浸泡4℃过夜，使用前1 h晾干。按1.2的方法进行细胞分组。分别于下室每孔加入浓度为10－10、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol/L 2HP-β-CD 36 μL及含0.5% FBS的等量培养液，另取含0.5% BSA的RPMI1640培养基、血清饥饿24 h的HUVEC细胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，制成含0.25% BSA 的RPMI1640细胞悬液，分别于上室每孔加入含细胞2.5×105/mL的细胞悬液200 μL。上、下室之间隔以8 μm PVPF聚碳酸膜，置于37℃、5% CO2培养箱中温育5 h。取出滤膜，Diff-Quick染液试剂盒固定、染色，取10个高倍视野计数迁移细胞数。

1.4统计学方法使用PRISM6.0统计软件，结果以珋x±s表示，两样本均数比较用t检验，多样本间比较采用单向方差分析Dunnet-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

N－10、N－9、N－8组细胞增殖活力较空白组显著增强(P均＜0.01) ; N－10、N－9、N－8组细胞增殖活力与2HP-β-CD浓度呈剂量依赖性(P＜0.05)。N－7、N－6、N－5组细胞增殖活力与对照组比较差异无统计学意义(P均＞0.05)。与空白组比较，N－9、N－8组内皮细胞迁移数明显增加(P均＜0.05)，其余浓度组与空白组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)。

表1　各组细胞增殖活力与迁移能力比较(n=6，±s)

注:与空白组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别　细胞增殖活力(OD450)　细胞迁移数(个)实验组N－10　2.82±0.17＊＊　40.67±2.91 N－9　3.18±0.15＊＊　112.17±29.27*N－8　3.34±0.13＊＊　116.67±21.92*N－7　2.39±0.19　78.67±18.26 N－6　2.57±0.24　86.33±8.17 N－5　2.17±0.07　40.41±4.66空白组2.04±0.20　49.60±4.55

3　讨论

完整的单层血管内皮细胞系统是血管壁发挥正常功能的必要条件，血管损伤可导致内皮功能丧失或失去完整性，引起动脉粥样硬化和血管再狭窄，因此促进和恢复内皮细胞完整性具有重要意义。血管新生是一个新的微血管发展成一个血流供应系统的过程。在血管新生过程中，首要步骤是内皮细胞在趋化因子的作用下发生迁移、增殖［6］。要达到治疗性血管新生的目的，血管新生诱导因子必须作用于微血管内皮细胞的特异性受体，引起微血管内皮细胞增殖、迁移，形成毛细血管样管腔结构，然后经过血管的重构形成新的毛细血管网［7，8］。

CD是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，具有亲水的外围和疏水的核心，其核心具有分子识别作用，可以选择性包络特定物质。CD通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元，其中研究较多的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-CD、β-CD和γ-CD［9］。研究表明，与CD同属于多糖的葡萄糖胺聚糖可以通过激活血管新生相关的生长因子受体来调节血管新生生长因子的活性，从而对血管内皮细胞有一定的作用。Folkman等［4］报道，β-CD可以刺激兔角膜血管新生达正常组的303%，对照组则为正常组的164%。

本研究显示，体外环境下，2HP-β-CD能够明显促进HUVECs的增殖和迁移。Bachinsky等［10］报道，β-CD是一种肝素类似物，可产生高密度负电荷，通过与染料和肝素结合性表皮生长因子(即成纤维细胞生长因子)等阳离子型分子结合而产生一定的生物学效应。本研究中，10－10、10－9、10－8mol/L的2HP-β-CD能够剂量依赖性地增加内皮细胞增殖活力，10－9和10－8mol/L的2HP-β-CD可显著促进内皮细胞迁移，可能是由于β-CD与肝素结合性表皮生长因子结合后形成复合物后，使肝素结合性表皮生长因子具有一定的缓释作用，从而稳定、持续地发挥生物学作用，目前已知肝素结合性表皮生长因子具有促进包括血管内皮细胞、间叶细胞和神经外胚层在内的一系列细胞增殖的作用，因此适当浓度的2HP-β-CD可能是通过上述机制促进HUVEC的增殖和迁移。本研究结果显示，高浓度的2HP-β-CD未能促进内皮细胞的增殖和迁移，推测其原因可能与过高浓度的2HP-β-CD产生过多的高密度负电荷，与肝素结合性表皮生长因子结合形成复合物后，难以释放出肝素结合性表皮生长因子，从而影响肝素结合性表皮生长因子与其受体的结合有关。

综上所述，2HP-β-CD能够明显促进血管内皮细胞增殖和迁移，推测其在缺血性疾病血管新生的发生和发展中具有一定作用，有利于缺血部位侧支循环的形成。其作用机制仍需进一步证实。

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Effect of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin on migration and proliferation of HUVECs

QI Xun1，YUAN Yong-hui，ZHONG Hong-shan，XU Ke
(1 The First Affiliated Hospital of China Medical University，Key Laboratory of Diagnostic Imaging and Interventional Radiology of Liaoning Province，Shenyang 110001，China)

Abstract:Objective To investigate the effect of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (2HP-β-CD) on the migration and proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro.Methods HUVECs were cultured in vitro and were divided into two groups: the experimental group and the blank group.HUVECs in the experimental group were treated with different concentrations of 2HP-β-CD (10(－10)-10(－5)mol/L)，and the same amount of 0.5% FBS was added into the blank group.CCK-8 was used to detect the cell proliferation activities of the two groups，and the modified Boyden Chamber was applied to observe the cell migration in each group.Results The OD(450)of the experimental group which was added with 10(－10)mol/L，10(－9)mol/L and 10(－8)mol/L 2HP-β-CD was 1.4，1.6 and 1.7 times higher than that of the blank group; and 10(－10)mol/L 2HP-β-CD had the most significant effect in promoting the proliferation of HUVECs (all P＜0.01).No significant difference was found in OD(450)of the two groups when we added 10(－7)，10(－6)and 10(－5)mol/L 2HP-β-CD to HUVECs.The migration of HUVECs which were added with 2HP-β-CD at the concentration of 10(－9)mol/L and 10(－8)mol/L in the experimental group was significantly higher than that of the blank group (all P＜0.05).When we added other concentrations of 2HP-β-CD，no significant difference was found in the cell migration between the experimental and blank groups.ConclusionSuitable concentrations of 2HP-β-CD can promote the migration and proliferation of HUVECs.

Key words:2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin; umbilical vein endothelial cells; cell migration; cell proliferation; angiogenesis

(收稿日期:2015-01-30)

通信作者简介:徐克(1954-)，男，教授，博士，研究方向为介入放射学。E-mail: kexu@ vip.sina.com

作者简介:第一戚勋(1980-)，女，讲师，血管分子生理学博士，研究方向为缺血模型的血管新生。E-mail: qixun716@ hotmail.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81201168) ;辽宁省教育厅一般项目(L2012282)。

文章编号:1002-266X(2015) 18-0004-03

文献标志码:A

中图分类号:R331.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.002