痛风性关节炎患者外周血单个核细胞中ASC及其亚型的表达和意义

杨其彬，何泳龙，青玉凤，刘璐，周京国(川北医学院附属医院，四川南充637000;2成都中医药大学临床学院)

痛风性关节炎患者外周血单个核细胞中ASC及其亚型的表达和意义

杨其彬1，2，何泳龙1，青玉凤1，刘璐1，周京国1
(1川北医学院附属医院，四川南充637000;2成都中医药大学临床学院)

摘要:目的观察痛风性关节炎(GA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及其亚型(ASC-b)的表达变化，并探讨其临床意义。方法选择急性痛风性关节炎(AGA组)、痛风性关节炎间歇期(IGA 组)和正常体检者(对照组)各48例采用实时荧光定量PCR及Western blot方法分别检测PBMCs中ASC mRNA和蛋白及核因子(NF) -κB p65蛋白表达。结果AGA组ASC mRNA表达显著高于IGA组及对照组(P均＜0.01)，IGA与对照组比较差异无统计学意义; AGA组与IGA组ASC蛋白表达显著低于对照组(P均＜0.01)，且IGA组最低(P＜0.01)，AGA组ASC-b蛋白表达显著高于IGA组和对照组(P均＜0.01)，IGA组最低(P＜0.05) ; AGA组NF-κB p65蛋白表达显著高于IGA组和对照组(P均＜0.01)，IGA组与对照组比较差异无统计学意义。结论AGA患者PBMCs中ASC及其亚型ASC-b表达异常，提示ASC及其亚型在GA的病理机制中发挥了重要功能。

关键词:痛风性关节炎;凋亡相关斑点样蛋白;核因子-κB;外周血单个核细胞

痛风性关节炎(GA)是由尿酸盐(MSU)沉积于关节或关节旁组织而导致的局部炎症，MSU通过刺激核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性体活化，募集凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1形成炎性体复合物，介导炎症因子IL-1β 和IL-18前体成熟和分泌。ASC是细胞内的一种重要的连接蛋白，能够募集上游的受体蛋白和下游的炎症相关蛋白形成一个稳定的蛋白复合体，即炎性体。另外，激活核因子(NF) -κB信号通路将介导大量炎症因子转录，ASC可通过NF-κB信号通路调节炎症因子转录。本研究通过检测GA患者外周血单个核细胞(PBMCs)中ASC及其亚型ASC-b水平，探讨ASC及其亚型ASC-b在GA炎症反应机制中的作用。

1　资料与方法

1.1临床资料选择川北医学院附属医院2013年1月～2014年6月收治的GA急性期(AGA)患者48 例(AGA组)，均符合1977年美国风湿病协会(ACR)发布的诊断标准; GA间歇期(IGA)患者48 例(IGA组)，均为AGA后至少2周、血沉和CRP正常者，排除痛风石形成、尿酸盐肾病及尿酸性尿路结石患者。患者均为男性，AGA组年龄21～63(42.6 ±11.5)岁，病程(6.3±3.1)年; IGA组年龄18～57 (38.2±8.3)岁，病程(5.3±2.8)年。对照组为48例男性健康体检者，年龄24～55(38.6±10.2)岁，均无痛风家族史、心脑血管病史、感染等炎症疾病，实验室指标无异常。三组性别、年龄具有可比性。

1.2实验方法

1.2.1ASC mRNA检测采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)方法。ASC及内参β-actin基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，ASC上游: 5'-GATGCTCTGTACGGGAAGGTC-3'，下游: 5'-TCCAGTTCCAGGCTGGTGT-3'，产物长度115 bp;β-actin上游: 5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'，下游: 5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3'，产物长度128 bp。取肝素钠抗凝外周静脉血3 mL，人淋巴细胞分离液(Ficoll)分离PBMCs，Trizol试剂提取总RNA并逆转录合成cDNA，RT-PCR总体积为25 μL反应体系: 12.5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，各1 μL 10 pmol/L引物，2 μL cDNA，8.5 μL双蒸水。反应条件为: 95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。每份标本均设复孔。所有扩增均在ABI 7900 Real-Time PCR仪上进行。反应结束后作溶解曲线。以目的基因的Ct值减去内参的Ct值为ΔCt，2－ΔΔCt值表示目的基因mRNA表达水平。所有标本均重复检测2次取均值。

1.2.2ASC、ASC-b及NF-κB p65蛋白检测采用Western blot方法。随机提取AGA、IGA及对照组PBMCs总蛋白各6例，进行BCA蛋白浓度定量，取等量蛋白上样量，十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜(ASC、NF-κB p65、GAPDH稀释度均为1∶1 000)，二抗室温孵育1 h(二抗稀释度1∶3 000)，TBST洗膜后ECL化学发光试剂盒显色，使用Fusion Fx5曝光成像，Image J软件对显影条带灰度值进行分析，以GAPDH作为内参，ASC/GAPDH、ASC-b/GAPDH、NF-κB p65/GAPDH灰度值作为目的蛋白表达量。

1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件，基因表达水平2－ΔΔCt值及蛋白水平以珋x±s表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，组间两两比较采用Mann-Whitney检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组ASC mRNA表达AGA组、IGA组、对照组的ASC mRNA表达分别为0.027 5±0.023 9、0.022 2±0.027 7、0.017 1±0.0172 2，三组比较差异有统计学意义(P＜0.01) ;进一步两两比较发现，AGA组显著高于IGA和对照组(P＜0.05或＜0.01)，IGA组与对照组比较差异无统计学意义。

2.2各组ASC及ASC-b蛋白表达AGA组、IGA组、对照组的ASC蛋白表达分别为0.72±0.22、0.45±0.09、1.87±0.21，AGA组、IGA组显著低于对照组(P均＜0.01)，IGA组最低(P＜0.05)。AGA组、IGA组、对照组的ASC-b蛋白表达分别为2.51±0.38、0.45±0.16、0.86±0.33，AGA组显著高于IGA组和对照组(P均＜0.01)，IGA组亦最低(P＜0.05)。

2.3各组NF-κB p65蛋白表达AGA组、IGA组、对照组的NF-κB p65蛋白表达分别为1.12±0.13、0.48±0.21、0.40±0.15，AGA组显著高于IGA组和对照组(P均＜0.01)，IGA组高于对照组，但差异无统计学意义。

3　讨论

GA是因MSU沉积于关节或关节旁组织引起的，Martinon等［1］研究显示，MSU能活化核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性体，介导IL-1β和IL-18的成熟和分泌，引起炎症反应。释放至胞外的IL-1β通过与IL-1受体结合，激活IL-1信号通路和髓样分化因子依赖的NF-κB通路，引起大量促炎因子转录，产生炎症级联放大效应［2］。由此可见，NLRP3炎性体信号通路在识别并结合MSU触发痛风炎症反应过程中发挥重要作用。

ASC作为NLRP3炎性体中重要的接头分子蛋白，其分子结构中含有两个保守的结构域，分别为热蛋白样结构(PYD)和胱天蛋白募集结构域(CARD)，这两个结构域都具有保守的疏水性氨基酸，并且每个结构域都含有六个保守的α-螺旋［3］。ASC通过六α-螺旋结构实现自身的寡聚化，从而募集并激活与其含有同源结构域的其他蛋白，形成一个稳定的蛋白复合体即炎性体，在炎症反应和细胞凋亡等信号通路中发挥重要作用［4，5］。许多上皮细胞、白细胞和外周淋巴细胞都表达ASC，但其主要在单核细胞和黏膜上皮中表达，IL-1α、IL-1β、IFN-α、IFN-γ、TNF-α和脂多糖(LPS)可上调ASC表达［6］。Bryan等［7］报道，ASC蛋白具有三种亚型，分别为ASC-b、ASC-c和ASC-d。其中，ASC和ASC-b具有完整的PYD和CARD结构域，能够与NLRP3结合形成炎性体，激活下游的caspase-1，并诱导IL-1β等炎症因子的释放。

本研究采用实时定量PCR方法检测GA患者PBMCs中ASC mRNA表达水平，结果显示，AGA组、IGA组及对照组的ASC mRNA表达比较差异有统计学意义，AGA显著高于IGA及对照组，IGA与对照组无统计学差异。表明痛风急性发作期患者ASC基因表达显著升高［8］，ASC在痛风急性炎症过程中发挥关键作用。

ASC及其亚型ASC-b能够与NLRP3结合形成炎性体，诱导炎症因子释放，参与炎症反应，而沉默ASC则会减少这些炎症因子的产生和成熟［9］。ASC 与ASC-b的区别在于缺失了中间93～111位置的氨基酸即所谓的铰链区，铰链区能够弯曲自我聚集，有利于NLRP3炎性体平台的形成［10］，而缺乏铰链区将削弱ASC衔接NLRP3及caspase-1的能力，减少IL-1β的成熟［3］。另有研究报道，ASC对caspase-1的活化、成熟与ASC-b相比差异无统计学意义，但ASC-b促进IL-1β的分泌显著高于ASC［11］，说明ASC-b促进IL-1β成熟和分泌的作用更强。我们发现，AGA及IGA组ASC表达均低于对照组，且IGA最低，而AGA组ASC-b表达显著高于IGA及对照组，IGA组亦最低。IGA患者PBMCs中ASC及ASC-b蛋白水平显著降低，说明ASC及其亚型通过减少NLRP3炎性体形成，抑制IL-1β的成熟和释放，炎症反应减弱，病情得到缓解。

研究发现，ASC还参与NF-κB信号通路的调节。Stchlik等［12］体外研究显示，ASC对NF-κB信号通路具有双重调节特性，ASC与NLRP3结合能够导致NF-κB活化;当仅有ASC时，其通过抑制细胞内IκB激酶的磷酸化来抑制NF-κB活化。本研究显示，AGA患者PBMCs中NF-κB p65蛋白表达明显高于IGA和对照组，IGA组与对照组比较差异无统计学意义，提示ASC除参与NLRP3炎性体通路外，可能还参与活化NF-κB，引起促炎因子转录，参与GA的急性炎症反应。

综上所述，GA患者PBMCs中ASC基因、蛋白及其蛋白亚型表达异常，ASC及其亚型可能通过影响NLRP3炎性体的形成，参与痛风的炎症反应过程。

参考文献:

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Expression and significance of ASC and its subtype in PBMCs of patients with gouty arthritis

YANG Qi-bin1，HE Yong-long，QING Yu-feng，LIU Lu，ZHOU Jing-guo
(1 Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expression changes of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC) and its subtype (ASC-b) in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with gouty arthritis (GA) and to investigate the clinical significance.Methods The expression levels of ASC mRNA and protein and nuclear factor (NF) -κB p65 protein in the PBMCs were detected in 48 cases of patients with acute gouty arthritis (AGA group)，48 cases of patients with gouty arthritis in the intermission (IGA group) and 48 cases of healthy controls (HC group) by using real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (PCR) and Western blotting.Results The expression of ASC mRNA in the AGA group was significantly higher than that of the IGA and HC groups (all P＜0.01)，and there was no difference between IGA and HC groups.The expression of ASC protein in the AGA and IGA groups was significantly lower than that of the HC group (all P＜0.01)，and the IGA group was the lowest (P＜0.01).The expression of ASC-b protein in the AGA group was significantly higher than that of the IGA and HC groups (all P＜0.01)，and the IGA group was the lowest (P＜0.05).The expression of NF-κB p65 protein in the AGA group was significantly higher than that of the IGA and HC groups (all P＜0.01)，and there was no statistical difference between the IGA and HC groups.Conclusion The expression of ASC and its subtype (ASC-b) in the PBMCs of patients with AGA is abnormal，which indicates that ASC and ASC-b may play a critical role in the pathogenesis of GA.

Key words:gouty arthritis; apoptosis-associated speck-like protein; nuclear factor-κB; peripheral blood mononuclear cells

(收稿日期:2015-02-03)

通信作者简介:周京国(1963-)，男，博士生导师，教授，研究方向为自身免疫性疾病基础与临床研究。E-mail: jgzhou@ nsmc.edu.cn

作者简介:第一杨其彬(1983-)，男，博士研究生，研究方向为自身免疫性疾病基础与临床研究。E-mail: yangqb_001@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81272047) ;四川省教育厅科研项目(15ZB0202)。

文章编号:1002-266X(2015) 18-0001-03

文献标志码:A

中图分类号:R593

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.001