肝癌组织中HuR和HIF-1α的表达及其相关性

刘利平，江建新，鲍世韵，张育森，何婉(暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院，广东深圳5800;湖北省肿瘤医院)

肝癌组织中HuR和HIF-1α的表达及其相关性

刘利平1，江建新2，鲍世韵1，张育森1，何婉1
(1暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院，广东深圳518020;2湖北省肿瘤医院)

摘要:目的观察人抗原R(HuR)和缺氧诱导因子(HIF) -1α在肝癌组织中的表达变化，并探讨其相关性。方法取48例肝癌组织及癌旁组织标本，采用免疫组化染色法检测肝癌组织及癌旁组织中HuR和HIF-1α蛋白的表达，采用荧光定量PCR法检测肝癌组织中HIF-1α mRNA的表达。结果肝癌组织中HuR和HIF-1α蛋白阳性表达率分别为67%和58%，显著高于癌旁组织的19%和10% (P均＜0.01)。肝癌组织中HuR与HIF-1α蛋白的表达呈正相关(r=0.723，P＜0.01)。HuR蛋白高表达者中HIF-1α mRNA的表达较HuR蛋白低表达者显著上调(P ＜0.05)。结论肝癌组织中HuR和HIF-1α蛋白表达上调且呈正相关关系，HuR可能增强HIF-1α mRNA的稳定性，从而促进其表达。

关键词:肝癌;人抗原R;缺氧诱导因子-1α; RNA结合蛋白

实体瘤在生长过程中，由于肿瘤细胞增殖过快和新生血管功能缺陷，常常造成局部组织微环境缺氧。缺氧诱导因子(HIF) -1α是介导肿瘤适应缺氧状态的重要转录因子［1］，在缺氧状态下可转运至细胞核内，与HIF-1β结合成为有活性的HIF-1复合物，再与下游靶基因的缺氧反应元件(HRE)结合，启动下游靶基因的转录，促进肿瘤细胞生长、侵袭、转移和化疗耐药［1，2］。然而缺氧状态下细胞内基因转录常常受到抑制，蛋白翻译也通常受阻。人抗原R(HuR)为RNA结合蛋白，可通过与靶基因末端富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列结合，增强mRNA的稳定性和调节蛋白翻译［2，3］。因此，HIF-1α和HuR分别在转录水平和转录后水平调节肿瘤细胞对缺氧的适应性。本研究对肝癌组织中HIF-1α和HuR蛋白表达情况进行检测，分析二者的相关性。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料选择深圳市人民医院2013～2014年行手术切除的肝癌患者48例，男46例、女2例，年龄31～65岁、平均49.5岁。其中乙肝表面抗原阳性35例。患者术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗。取手术切除的肝癌组织及对应的癌旁组织(距肿瘤边缘2 cm以上)各48例份，液氮中保存备用。标本经10%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋。所有标本均经病理组织学检查证实。

1.2检测指标

1.2.1HuR和HIF-1α蛋白检测采用免疫组化法。将石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2室温孵育15 min灭活内源性过氧化物酶，微波抗原修复，滴加10%山羊血清37℃封闭1 h。弃封闭液，加入100 μL鼠抗人HuR单克隆抗体(1∶200稀释)，4℃过夜。依次滴加生物素化二抗、亲和素(试剂A)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素(试剂B)，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。显微镜下观察染色结果，以PBS代替一抗做为阴性对照。HuR阳性表达为细胞核染棕黄色，HIF-1α阳性表达为细胞核和(或)细胞质染棕色。结果判定采用半定量计分法，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞率乘积来判定。染色强度评分标准:无特异染色为0分，轻度染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分;阳性细胞率评分标准:无为0分，1%～25% 为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两项乘积等于0～4分为低表达，5～12分为高表达。

1.2.2HIF-1α mRNA检测采用Real-time PCR法。取约2 mm3大小的肿瘤组织，加入TRIZol液提取细胞总RNA，取1 μg逆转录为cDNA。采用Premier Primer 5软件设计基因引物，HIF-1α引物上游5'-ACTTCTGGATGCTGGTGATTTG-3'，下游5'-GCTTCGCTGTGTGTTTTGTTCT-3';β-actin引物上游5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，下游5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。将cDNA稀释10倍，向每个PCR反应孔中加入1 μL，并加入10 nmol的上、下游引物各0.5 μL，无核酸酶的超净水8 μL和SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反应在ABI 7900HT荧光定量PCR检测系统上运行，程序设置为: 95℃2 min; 95℃10 s，60℃60 s，循环40次; 72℃延伸10 min。扩增完毕后进行熔解曲线分析。实验重复3次，采用2－ΔΔCt计算相对mRNA表达。

1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件，计量资料用珋x±s表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法，非正态分布资料采用Mann-Whitney检验，相关性分析采用Spearman相关检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肝癌组织和癌旁组织中HuR和HIF-1α蛋白表达HuR蛋白在肝癌中的表达主要定位于细胞核，为粗细不一的棕褐色颗粒，并有明显的异质性。肝癌组织和癌旁组织中的HuR蛋白阳性表达率分别为67%(32/48)和19%(9/48)，二者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。HIF-1α蛋白在肝癌中的表达主要定位于胞质中，部分细胞核也有表达，呈棕黄色弥漫性分布。肝癌和癌旁组织中的HIF-1α蛋白阳性表达率分别为58% (28/48)和10% (5/48)，二者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2肝癌组织中HuR蛋白与HIF-1α蛋白表达的相关性48例肝癌组织标本中，HuR和HIF-1α均低表达14例，均高表达25例。同一标本中以HIF-1α表达阳性细胞染色强度和阳性细胞率乘积评分为横坐标，HuR表达评分为纵坐标，制成散点图，见图1。由图1可见，肝癌组织中的HuR与HIF-1α表达呈正相关(r=0.723，P＜0.01)。

2.3肝癌组织中HuR蛋白表达与HIF-1α mRNA的关系将肝癌组织根据HuR表达的高低分为两组，HuR高表达组HIF-1α mRNA表达为7.96± 1.79，HuR低表达组为3.55±1.26，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3　讨论

HuR蛋白是胚胎致死异常视觉基因家族中最重要的RNA结合蛋白，可通过与靶基因末端富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列结合，增强mRNA的稳定性并调控其蛋白翻译。HuR在多种正常组织中都有表达，主要分布于细胞核，在炎性因子、缺氧等因素的刺激下表达增高［3，4］。HuR在膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌及结肠癌等恶性肿瘤中的表达较正常组织明显升高，并与患者预后相关［5～7］。本研究发现，HuR蛋白在肝癌组织中的表达较癌旁组织中显著增高，提示HuR可能与肝癌的发生关系密切。HuR通过与其靶基因(如c-myc、P53、Cyclin D1、Cyclin A、survivin、Bcl-2、COX-2、TNF-α、VEGF、MMP-9)结合，调控癌基因、细胞周期、细胞凋亡、炎症因子、侵袭转移等相关分子，在肿瘤发生及恶性转化等方面发挥重要作用［8，9］。

HuR蛋白的表达受多方面因素的调控。NF-κB、Smad转录因子可与HuR启动子结合促进其转录，在转录水平上调HuR mRNA的表达。然而miR-9、miR-16、miR-34a、miR-125a和miR-519等微小RNA可与HuR的3'-末端翻译区结合，下调HuR蛋白及mRNA的表达［9］。本研究发现，HuR与HIF-1α蛋白在肝癌组织中的表达呈正相关关系，HIF-1α在肿瘤组织中的表达高低通常反映缺氧程度，提示缺氧可能是刺激HuR表达的重要因素。在缺氧状态下，HIF-1α与HIF-1β结合成为有活性的HIF-1复合物，与受其调节的下游靶基因HRE结合，形成转录起始复合物，启动下游靶基因的转录［1］。HIF-1α能否通过与HuR启动子结合促进其基因转录和蛋白表达还有待进一步研究。

HIF-1α的表达与缺氧密切相关，在缺氧状态下泛素化蛋白水解酶受抑制，HIF-1α蛋白降解减少，从而表达增加［1］。然而在缺氧状态下细胞整体转录水平下降，因此HIF-1α mRNA的表达应该受到抑制［3］。研究表明，HuR蛋白可以增强细胞内mRNA的稳定性。为明确HIF-1α mRNA与HuR蛋白表达的关系，我们将肝癌组织根据HuR表达的高低分为两组，结果显示，HuR高表达组HIF-1α mRNA表达较低表达组明显增高，提示HuR蛋白可能在mRNA水平调节HIF-1α的表达。研究证实，HIF-1α mRNA 的3'-和5'-末端翻译区携带有多个ARE［8］。因此，虽然缺氧导致HIF-1α基因转录受到抑制，但是HuR可能增加HIF-1α mRNA的稳定性，从而上调HIF-1α蛋白的表达。同时，在CoCl2模拟缺氧条件下，HuR还可以促进HIF-1α蛋白翻译［8］。因此，HuR蛋白在肝癌组织中可以通过多种机制上调HIF-1α的表达。

综上所述，HuR和HIF-1α蛋白在肝癌组织中表达明显上调，且两者表达呈正相关关系。HuR可能通过稳定HIF-1α mRNA和促进其翻译，从而上调HIF-1α的表达。

参考文献:

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Expression and correlation of HuR and HIF-1α in hepatocellular carcinoma

LIU Li-ping1，JIANG Jian-xin，BAO Shi-yun，ZHANG Yu-sen，HE Wan
(1 The Second Clinical Medical College of Jinan University，Shenzhen People's Hospital，Shenzhen 518020，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and correlation of human antigen R (HuR) and hypoxia-inducible factor (HIF) -1α in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues.Methods Forty-eight cases of HCC tissue and adjacent tissue samples were collected from patients undergoing surgical resection.The expression of HuR and HIF-1α protein in the HCC and adjacent tissues was detected by immunohistochemical staining.The mRNA expression of HIF-1α in the HCC tissues was detected by fluorescent quantitative PCR.Results The positive expression rates of HuR and HIF-1α protein in the HCC tissues were 67% and 58%，respectively.These rates were significantly higher than the positive expression rates of HuR and HIF-1α protein (19% and 10 %) in the adjacent tissues (all P＜0.01).The expression of HuR protein was positively correlated with the expression of HIF-1α protein in the HCC tissues (r=0.723，P＜0.01).The mRNA expression of HIF-1α mRNA in the group with high expression of HuR protein was significantly up-regulated as compared with that of the group with low expression of HuR protein (P＜0.05).Conclusions The expression of HuR and HIF-1α protein was up-regulated and positively correlated with each other in the HCC tissues.HuR may enhance the stability of HIF-1α mRNA，and thus increase the expression of HIF-1α protein.

Key words:liver carcinoma; human antigen R; hypoxia-inducible factor-1α;RNA-binding protein

(收稿日期:2015-02-03)

通信作者简介:何婉(1978-)，女，主治医师，研究方向为肿瘤基础与临床。E-mail: hewanshenzhen@ hotmail.com

作者简介:第一刘利平(1982-)，男，主治医师，研究方向为肝癌基础与临床。E-mail: leoliping@ aliyun.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81402041、81160311)。

文章编号:1002-266X(2015) 18-0007-03

文献标志码:A

中图分类号:R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.003