三种免疫抑制剂对HBV质粒感染小鼠HBV复制的影响*

黄顺梅，王俊忠，宋志韬，王宝菊，朱珍妮，朱彬，陆蒙吉，杨东亮

三种免疫抑制剂对HBV质粒感染小鼠HBV复制的影响*

黄顺梅，王俊忠，宋志韬，王宝菊，朱珍妮，朱彬，陆蒙吉，杨东亮

作者单位：430022武汉市华中科技大学同济医学院附属协和医院感染病科（黄顺梅，王俊忠，宋志韬，王宝菊，朱珍妮，朱彬，杨东亮）；德国埃森大学医学院病毒研究所（陆蒙吉）

第一作者：黄顺梅，女，30岁，博士研究生。主要从事感染与免疫研究。E-mail：hshm1982@sina.com

【摘要】目的应用小鼠模型评价3种临床常用的免疫抑制剂对乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法利用高压水注射法将HBV质粒pAAV/HBV1.2导入Balb/C小鼠肝内，建立小鼠HBV复制模型；将Balb/C小鼠随机分成4组，每组10只，分别给予生理盐水（Saline）、FK506、DEX和CYP处理。1w后，将供体C57BL/6小鼠皮瓣移植至上述经免疫抑制剂或生理盐水处理的Balb/C小鼠，皮肤移植后继续使用上述免疫抑制剂或生理盐水至观察期结束。采用电化学免疫发光法检测血清HBsAg、HBsAb和HBcAb水平，采用Real-time PCR法检测血清病毒载量。结果FK506、地塞米松和环磷酰胺处理小鼠移植皮瓣的存活时间分别为（21.50±3.09）d、（21.50±3.09）d和（21.40± 1.52）d，分别较生理盐水处理组（8.67±1.86）d明显延长[P=0.037、P=0.000和P=0.000]；FK506处理组小鼠HBV复制及其抗体产生与对照组无显著性差异，地塞米松处理组在药物处理期间能维持病毒复制，但停药后病毒DNA 和HBsAg迅速下降至检测水平以下，至观察终点仍未检出HBsAb和HBcAb阳性，环磷酰胺能明显延长小鼠HBV复制的持续时间，即使在停药后16 w血清HBV DNA和HBsAg均维持在较高水平，HBcAb和HBsAb持续阴性。结论环磷酰胺而非FK506处理可在Balb/C小鼠模型中建立HBV持续复制模型。

【关键词】乙型肝炎病毒；免疫抑制剂；高压水注射；小鼠

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染仍然是一个重要的全球性公共卫生问题。我国是HBV感染的高发区，人群HBsAg携带率为7.18%[1]。免疫抑制药物的使用常可导致HBV感染的再激活或导致HBV的持续感染，但不同药物对HBV感染再激活的影响不同[2，3]。因此，有必要利用合适的动物模型来评价不同免疫抑制药物对HBV感染的影响，为临床合理选择免疫抑制药物及预防HBV再激活提供指导。通过尾静脉高压水注射（Hydrodynamic injection，HI）将HBV质粒pAAV-HBV1.2导入小鼠体内建立的小鼠HBV复制模型是已经得到全世界公认且现今广泛应用的由台湾国立大学陈培哲教授团队创建的，其最初的研究成果发表在2006年PNAS[4～6]。pAAVHBV1.2导入Balb/C和C57BL6小鼠能分别构建急性和持续的HBV复制模型。他克莫司（Tacrolimus，FK506）、地塞米松（Dexamethasone，DEX）和环磷酰胺（Cyclophosph-amide，CYP）是临床常用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤和抑制移植物排斥反应的药物。本研究应用该Balb/C小鼠模型来评价上述药物对HBV感染的影响，以期为临床防治HBV感染提供重要参考。

1　材料与方法

1.1动物、试剂与药物SPF级6～8周龄雌性Balb/C小鼠购自湖北省疾病预防控制中心，在SPF级动物实验室中饲养。所有动物实验均符合本校动物实验伦理学委员会的规定。pAAV/HBV1.2为台湾国立大学陈培哲教授馈赠；检测HBsAg、HBsAb和HBcAb试剂盒购自瑞士Roche公司；DnaseⅠ（RNase free）购自日本TAKARA公司；SYBRRGreen Real-time PCR Master Mix购自日本TOYOBO公司；QIAamp miniElute virus kit购自德国QIAGEN公司。DEX购自上海通用药业股份有限公司，FK506和CYP购自江苏恒瑞制药有限公司。

1.2免疫抑制药物处理取FK506、DEX和CYP，分别用生理盐水稀释后腹腔注射，每只小鼠每次注射体积为0.25ml，剂量分别为5 mg·kg-1·2d-1[7]、10 mg·kg-1· d-1[8]和25mg·kg-1·4d-1[9]。

1.3皮肤移植实验将Balb/C小鼠随机分成4组，每组10只，分别给予生理盐水（Saline）、FK506、DEX和CYP处理。1w后，将供体C57BL/6小鼠（雄性，8～10周龄）皮瓣移植至上述经免疫抑制剂或生理盐水处理的Balb/C小鼠，皮肤移植后继续使用上述免疫抑制剂或生理盐水至观察期结束。每日监测移植皮瓣的存活情况，90%以上移植皮瓣未坏死则判为存活[10]。

1.4免疫抑制剂处理对HBV复制的影响将Balb/C小鼠随机分为4组，每组10只。自尾静脉高压水注射前1w至高压水注射后10w，分别接受不同免疫抑制剂或生理盐水处理。Week 0，每只小鼠自尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒10μg，具体注射方法同前[4]。在质粒注射后1 days post injection（dpi）、4 dpi、7 dpi、2 week post injection（wpi）、3 wpi、4 wpi、5 wpi、6 wpi、7 wpi、8 wpi、10 wpi、12 wpi、14 wpi、16 wpi、18 wpi、20 wpi、22 wpi、24 wpi、26 wpi采集小鼠眼眶静脉血，分离血清，备检。

1.5血清HBsAg、HBsAb和HBcAb定量检测取小鼠血清，用通用稀释液（Roche）1:10稀释，采用定量测定试剂盒（Roche，电化学免疫发光法，ECLIA）检测。HBcAb的检测结果以抑制率表示，计算公式为：抑制率= 100×（通用稀释液检测值-样本检测值）/通用稀释液检测值）×100。

1.6 HBV DNA定量检测取血清44.5μl，用DNaseⅠ消化血清中的质粒DNA，然后用QIAamp mini Elute viral DNA kit抽提血清病毒DNA。使用SYBR

Green Real time PCR Master Mix在Roche Light Cycler定量PCR仪上进行定量PCR检测[11]。PCR反应程序如下：95℃30s预变性；95℃5s变性，50℃5s退火，72℃30s延伸，连续40个循环。所用引物为：上游引物5'-CTG CAT CCT GCT GCT ATG-3' （nt408～425），下游引物5'- CAC TGA ACA AAT GGC AC-3'（nt 685～701）。用1:10倍比稀释的HBV质粒作为标准品，同时设置已知HBV DNA拷贝数的样本（质粒pAAV/HBV1.2分光光度计测OD260值，计算核酸浓度及其拷贝数，拷贝数=（OD260×50×106／（324.5×660）×（6.02×1023）作为阳性对照，以阴性样本作为阴性对照。

1.7统计分析应用SPSS 15.0统计软件对实验数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P< 0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1免疫抑制剂处理对小鼠移植皮瓣存活时间的影响经FK506、DEX和CYP处理小鼠移植皮瓣的存活时间分别为（21.50±3.09）d、（21.50±3.09）d和（21.40±1.52）d，分别较生理盐水处理组[（8.67±1.86）d，P=0.037、P=0.000和P=0.000]明显延长（图1），提示上述三种免疫抑制剂能明显抑制小鼠排斥反应，从而明显延长移植皮瓣的存活时间。

2.2 FK506、DEX、CYP处理对HBV质粒转染小鼠血清HBV DNA和HBsAg水平的影响将pAAV-HBV1.2导入小鼠体内后，生理盐水处理组小鼠血清HBsAg和HBV DNA在第4 d达峰值，但随后迅速下降，并在第6 w和第8 w转阴；FK506处理小鼠血清HBsAg和HBV DNA的变化与生理盐水处理组类似；DEX处理组小鼠血清HBsAg和HBV DNA在第4 d达峰值，在用药期间维持较高水平，但停药后4 w检测发现HBV DNA低于检测水平，HBsAg迅速下降至临界水平，且在60%小鼠其临界水平持续至观察期结束；CYP处理组小鼠血清HBsAg和HBV DNA同样也在第4d达到高峰，且在50%小鼠维持在较高水平，直到观察期末（停药后16w，图2）。

2.3 FK506、DEX、CYP处理对HBV质粒转染小鼠血清HBsAb和HBcAb的影响在注射前及注射后第7w、10w和26w检测小鼠血清HBsAb和HBcAb。注射前所有小鼠血清HBsAb和HBcAb均为阴性。在注射后7w、10w和26w，生理盐水处理组7只小鼠分别有4只、3只和1只血清HBcAb为阳性，而血清HBsAb阳性的小鼠数量在上述时间点均为4只；DEX处理组上述时间点所有小鼠HBcAb和HBsAb均为阴性；FK506处理组小鼠HBcAb在第7w仍为阴性，但第10w有1只小鼠HBcAb接近检测临界值，第26w，3只小鼠检出HBcAb阳性，而HBsAb在注射后7w、10w 和16w均有2只小鼠为阳性；CYP处理组小鼠在上述时间点HBcAb和HBsAb均为阴性（图3）。

3　讨论

已知免疫抑制药物的使用常可导致HBV感染的再激活或导致HBV的持续感染，因此在2010年发布的慢性乙型肝炎防治指南中建议对HBV感染者在使用免疫抑制剂前可给予核苷类似物治疗，而对HBcAb阳性的既往HBV感染者则需要定期监测。然而，不同药物对HBV感染持续或再激活的影响可能不同[2]，因此有必要利用动物模型评价常用的免疫抑制药物对HBV复制的影响，以指导HBV感染者和HBcAb阳性者选择合适的免疫抑制药物以及合适的临床监测方案。

2002年Chisari FV的研究小组通过高压水注射的方式将HBV复制性克隆导入小鼠肝脏后成功建立了HBV一过性复制的小鼠模型，但在注射HBV质粒后7 d和15 d分别从小鼠血清和肝内被清除。2006年台湾陈培哲研究小组在此基础上通过将pAAV-HBV1.2导入C57BL/6小鼠成功建立HBV持续复制小鼠模型，40%小鼠HBV复制的持续时间超过6 m，将该质粒导入Balb/C小鼠，2w后病毒被清除。随后不同的研究小组应用该方法建立小鼠HBV感染模型进行了相关研究，包括HBV清除的机制、HBV疫苗的评价等。因该小鼠模型易于操作，本文选择该小鼠模型来评价DEX、FK506和CYP对HBV复制的影响。

DEX、FK506和CYP是临床常用的用于自身免疫性疾病、肿瘤和抑制移植排斥反应的药物。DEX识别胞内糖皮质激素受体（GR）后使GR转移定位到核内，并与糖皮质激素应答元件GREs结合，从而导致免疫细胞的凋亡[12]。CYP是DNA烷化药物，是一种非特异性的细胞周期抑制剂，能选择性地减少B细胞数量，从而抑制体液免疫应答，亦能抑制T细胞介导的细胞免疫应答[13]。FK506能与FKBP12结合抑制钙通道活性，阻止细胞从G0期到G1期的分裂[14]。

我们发现FK506虽然能明显抑制移植排斥反应，但不能导致HBV复制的持续，也不会影响抗HBV相关抗原抗体的产生，与Robert E. Lanford的研究结果类似，后者在病毒接种前3w至接种后22w用FK506处理蜘蛛猴，并未导致长毛猴HBV（Wolly monkey HBV，WMHBV）的持续感染，同时对WMHBV DNA水平也未见明显的影响[15]。DEX在用药期间导致HBV高水平持续复制，停药后病毒DNA迅速被清除，但HBsAg可维持在极低水平，与在EV71和SARS-Cov观察到的情况不一致。EV71病毒感染小鼠和SARS-Cov病毒感染猪分别在病毒感染后2～3d或1～6d使用DEX处理，导致小鼠死亡率增加或临床症状加重，血清病毒滴度增加，可能因为上述两种病毒感染均为自限性，通常不导致持续感染[16，17]。CYP可在用药期间和停药后维持HBV的高水平复制，保持HBV持续复制时间长达26w，与在巨细胞病毒感染小鼠观察到的结果一致，即使仅在病毒接种前7d、5d、3d使用CYP，仍可使病毒感染的持续时间从14d延长至21d[9，18]。综上所述，上述三种药物对HBV复制的影响明显不同，FK506对HBV复制无明显影响，而DEX 和CYP可导致HBV感染的持续，这将为临床需要对HBV感染者和既往HBV感染者使用上述免疫抑制剂时监测HBV感染提供重要的参考。

在注射HBV质粒后10w，应用CYP处理动物，能使小鼠模型病毒复制的持续时间延长至26w，提示短暂的免疫抑制剂处理可能导致HBV感染的持续[2，3，19～21]。同时，通过短暂免疫抑制建立的HBV持续复制的Balb/C小鼠模型也有可能成为研究HBV感染的动物模型，特别是在对免疫抑制剂处理患者评价干预HBV感染的效果时具有重要意义。

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（收稿：2014-12-23）

（本文编辑：陈从新）

·实验性肝炎·

Impact of three immunosuppressors on HBV replication in HBV plasmid transfected mice

Huang

Shunmei，Wang Junzhong，Song Zhitao，et al. Department of Infectious Diseases，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

【Abstract】Objective To evaluate the effect of three commonly used immunosuppressors on HBV replication in mouse model. Methods pAAV/HBV1.2，a HBV plasmid，was introduced into livers of Balb/C mice by hydrodynamic injection to establish HBV replication model. Animals were treated with dexamethasone（DEX），tacrolimus（FK506），cyclophosphamide（CYP）or saline from 6 days before plasmid injection to 10 weeks after injection. HBsAg，HBsAb and HBcAb were detected by electrochemiluminescence immunoassay（ECLIA），and HBV DNA by real-time PCR. Results The survival time of the transplanted skin grafts in DEX，FK506，and CYP treated mice were（21.50±3.09），（21.50±3.09）and（21.40±1.52）days，respectively，much longer than that of grafts in saline treated mice [（8.67±1.86）d，P=0.037，P=0.000 and P=0.000，respectively]；HBV replication and antibody generation in FK506 treated mice was similar to that in control group；HBV replication was maintained at the high level in DEX treated mice during the treatment period，however，HBV DNA and HBsAg levels dropped rapidly after the medicine withdrawal，while HBsAb and HBcAb were negative throughout the observation period；In CYP treated mice，HBV replication was prolonged and HBV DNA and HBsAg were at high levels even at week 16 after CYP withdrawal，while HBsAb and HBcAb were negative throughout the observation period. Conclusion The persistent replication of HBV in BALB/c mice can be achieved by administration of CYP rather than FK506.

【Key words】Hepatitis B virus；Immunosuppressor；Hydrodynamic injection；Mice

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.004

通讯作者：王宝菊，E-mail:bjwang73@163.com

*基金项目：国家传染病防治科技重大专项课题（2008ZX10002011）