小分子干扰RNA沉默高迁移率族蛋白B1抑制肝星状细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成*

葛文松，范建高，李光明

小分子干扰RNA沉默高迁移率族蛋白B1抑制肝星状细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成*

葛文松，范建高，李光明

作者单位：200092上海市上海交通大学医学院附属新华医院消化内科

第一作者：葛文松，男，37岁，博士研究生，主治医师。主要从事慢性肝病及炎症性肠病诊治的基础与临床研究。E-mail:gewensong@126.com

【摘要】目的研究小分子干扰RNA（siRNA）干扰高迁移率族蛋白B1（HMGB 1）表达对肝星状细胞（HSC）Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的影响。方法将化学合成的HMGB 1基因特异性siRNA以脂质体包裹，转染HSC-T6细胞，设阴性对照和空白对照，抽提细胞总RNA和蛋白质，采用Western blot法检测细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达情况；采用细胞免疫荧光法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达与定位；采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原水平。结果转染HMGB 1基因特异性siRNA的HSC-T6细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白水平显著下调，免疫细胞化学检测也提示转染siRNA后细胞内Ⅰ型和Ⅲ型胶原水平较对照组明显降低；在培养72 h时，上清液Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原水平分别较对照组下降了（46.36±3.82）%和（41.92±3.58）%（F=33.14，P<0.01；F=27.56，P<0.01）。结论HMGB 1特异性siRNA能高效抑制HSC-T6细胞胶原的合成和分泌，因而可能具有预防和治疗肝纤维化的潜力。

【关键词】肝星状细胞；小分子干扰RNA；高迁移率族蛋白B1；胶原

肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSC）的激活是肝纤维化发生发展的关键环节。HSC激活的始动因素是肝脏损伤和炎症反应，而HSC激活的过程包括早期启动和后期持续激活，激活的“持久性”是维持HSC激活状态及产生细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），尤其是I型和Ⅲ型胶原的必要条件。近年来，研究表明高迁移率族盒染色体蛋白B1（Highmobility group box chromosomal protein 1，HMGB 1）在急、慢性肝损伤的发病过程中可能发挥着重要作用[1，2]。本课题组先前研究表明小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）HMGB1能高效抑制HSC-T6细胞HMGB1基因及蛋白水平表达[3]。本研究旨在进一步探讨siRNA沉默HMGB1后对活化的HSC表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原的影响，以明确抑制HMGB1表达对肝纤维化发生的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂肝星状细胞株HSC-T6细胞由美国加州大学旧金山分校（San Francisco General Hospital，USA，UCSF）肝脏中心实验室Friedman教授惠赠，其表型为活化的HSCs；RNA提取试剂盒和MTT均为美国Promega公司产品；Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品；鼠抗人HMGB1单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品；兔抗大鼠Ⅰ型和Ⅲ型胶原抗体为武汉博士德公司产品；羊抗鼠IgG二抗为上海优宁维公司产品；FITC标记的驴抗鼠二抗为美国Jackson Laboratories公司产品；所有siRNA均由上海诺百生物科技有限公司合成。

1.2引物设计依据siRNA设计原则，结合HMGB1基因序列特征，设计siRNA-HMGB1序列：正义链5'-ACCGGGCGAGCATCCTGGCTTATTTCAAGGAATA AGCCAGGAGCTCGCCCTTTTTC - 3'；反义链3'-CCGCTCGTAGGACCGAATAAAGTTCTCTTATTCG GTCCTACGAGCGGGAAAAAGAGCT-5'，序列两端包含BpiⅠ和XhoⅠ两个酶切位点。

1.3分组实验分为siRNA HMGB1组：转染siRNA HMGB1特异性干扰目的基因HMGB1的表达；阴性对照组：转染空白Lipofectamine 2000，以等体积的无牛血清双抗RPMI 1640补齐反应体系；空白对照组：以等体积的无牛血清无双抗RPMI 1640培养液代替转染液，代表转染前水平。

1.4 HSC-T6细胞培养与转染采用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞长至70%～80%密度时进行传代。转染前24 h，传代至24孔培养板，每孔1×105细胞。取HSC-T6细胞，用无牛血清双抗培养液分别稀释Lipofectamine2000和siRNA至所需浓度（siRNA终浓度为20 μmol/L）。将稀释的siRNA和Lipofectamine 2000各取10 μL混匀，静置20 min，使形成稳定的siRNA-脂质体混合物，将上述混合物加入待转染细胞，6h后，更换为完全培养液继续培养。

1.5细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的检测采用Western blotting法，取HSC-T6细胞6×106个，PBS洗涤后，提取胞质蛋白，采用BCA法行蛋白定量，与等体积的2×SDS上样缓冲液混合。取50μg蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜、封闭，分别加入抗Ⅰ型和抗Ⅲ型胶原抗体（1：500），4℃孵育过夜，洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的二抗（1：1 000），室温孵育3 h，经ECL检测、曝光和显影。

1.6细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达与定位检测采用免疫荧光法，将干扰组和空白对照组转染后培养48 h的六孔板从培养箱中取出，将6孔板中盖玻片取出，在PBS中蘸洗10次，吸干多余液体，再放入每孔装有2 ml多聚甲醛（CH2O）的六孔板中，室温固定10～15 min。取出固定好的盖玻片，在PBS中蘸洗20次，将其放在载玻片上，分别滴加抗Ⅰ型和Ⅲ型胶原抗体，4℃孵育过夜，PBS中蘸洗后再滴加荧光二抗，常温避光放置1h。PBS中蘸洗20次，封片。在激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM510，Carl Zeiss AG，Oberkochen，Germany）下观察胶原表达与定位情况。

1.7培养上清液胶原水平检测取培养3 d的细胞培养上清液100μL，采用ELISA法检测。

1.8统计学处理应用SPSS15.0统计学软件，数据以（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，二组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1 siRNA HMGB1对细胞胶原表达的抑制作用转染siRNA HMGB1的HSC-T6细胞表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原分别被抑制了（52.26±4.48）%（F=19.36，P<0.01）和（41.24±3.29）%（F=17.21，P<0.01），而阴性对照组和空白对照组细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达无显著性变化（图1）。

M C1 C2 R1 R2

Collagen1

2.2 siRNA HMGB1抑制HSC-T6细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达与定位情况使用激光共聚焦显微镜的光学断层扫描观察，以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6'-diamidino-2-phenylindole，DAPI）衬染细胞核，结果发现在活化的HSC细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原分布广泛，细胞质呈红色，细胞核呈蓝色，经软件融合（Merge）后，两者染色区域分布清晰。经siRNA HMGB1干扰后，细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达明显减弱（图2、图3）。

2.3 HSC培养上清液Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量变化的比较HMGB 1 siRNA转染HSC-T6细胞72 h后Ⅰ型胶原水平较对照组显著下降约（46.36±3.82）% （F=33.14，P<0.01）；Ⅲ型胶原水平比对照组下降约（41.92±3.58）%（F=27.56，P<0.01，表1）。

3　讨论

肝纤维化是一个慢性的病理过程，其发生发展与过多的炎性细胞因子及其引起的炎症反应密切相关[4～5]。目前认为，HSC激活及ECM的肝脏沉积是导致肝纤维化的主要原因[6]。HSC作为肝纤维化体外细胞研究已有数十年历史，在肝纤维化的形成中HSC是ECM形成的重要细胞[7]。因此，很多抗肝纤维化策略都聚焦于抑制HSC的活化、增殖及合成功能。

HMGB1是人们早在30年前就发现的一种非组蛋白核内结构蛋白。HMGB1广泛分布于淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织中。起初人们认为它在细胞核内能与DNA结合，对DNA重组、修复、复制和基因转录起重要作用。近年研究发现HMGB1不仅在细胞核内发挥作用，而且它被释放到胞外时可作为一种有效的炎症介质诱发和进一步扩大炎症反应的发生，是一种重要的炎症因子。HMGB1蛋白与多种疾病的发生发展密切相关。研究己经证实，HMGB1蛋白可以由坏死细胞被动释放，也可以由被激活的巨噬细胞或单核细胞主动分泌到细胞外，介导炎症反应。起初的研究发现，全身感染所致内毒素血症和肿瘤坏死因子的释放能刺激巨噬细胞主动分泌HMGB1，此后又证实多种炎症刺激可诱导巨噬/单核细胞主动分泌HMGB1。胞外的HMGB1既可作为细胞因子参与信号传导，又能进一步通过引发产生多种细胞因子和血管黏附分子，使炎细胞发生趋化作用，削弱上皮细胞的功能等启动炎症反应[8]。HMGB1也参与部分信号传导途径。研究表明，晚期糖基化终末产物受体（Receptor for advanced glycation end-products，RAGE）与HMGB1具有高亲和力，是HMGB1的主要受体[9]。当HMGB1与RAGE结合后，可引发MAPK磷酸化（包括p38MAPK、JN K1/2、ERK1/2）、核转录因子NF-κB和活化蛋白21的核内转移，使许多炎性因子如IL-1β、TNF-α、IL-8等表达加强和释放增多而启动炎症或使炎症恶化[10]。由此可见，HMGB1参与组织损伤/炎症反应/凋亡/免疫反应等多种病理过程，HMGB1有可能成为抗炎和防止组织损伤的重要靶点。

越来越多的研究提示HMGB1参与多种肝脏疾病的炎症过程，如在肝缺血/肝移植大鼠，均可发现HMGB1表达显著升高[11，12]。HMGBl mRNA在乙型肝炎患者肝组织的表达情况及其与病情严重程度及转归的关系也提示HMGB1与慢性乙型肝炎病情严重程度成正相关，能反应病情严重程度、预后及其转归，为此推断HMGB1很有可能参与肝纤维化的发生发展。我们在前期工作中也发现肝纤维化时HMGB1表达增高，并与纤维化程度呈正相关，其原因可能是肝纤维化的多种炎症刺激及细胞因子可诱导巨噬/单核细胞主动分泌HMGB1，胞外的HMGB1既能进一步通过引发产生多种细胞因子，使炎细胞趋化，启动炎症反应，又可作为细胞因子参与MAPK、NF-κB等信号传导，最终致使肝脏细胞外基质合成增加、降解减少而导致肝纤维化的发生[13]。更有研究表明HMGB1直接刺激成纤维细胞增殖而参与纤维化过程，而抑制HMGB1可有效治疗纤维化疾病，如Hamada et al研究表明抑制HMGB1可有效减轻肺纤维化[14]。

RNAi是一种转录后基因沉默的强大工具，化学合成siRNA能在哺乳动物体内外介导同源基因沉默，并具有治疗作用[15]。已有很多采用该技术用于实验性肝纤维化的干预研究[16，17]，并有应用于体内进行抗肝炎病毒、肝纤维化及肝衰竭的治疗研究[l8，19]。活化的HSC具有致炎、增殖、纤维形成的作用，抑制HSC活化与增殖已公认为是防治肝纤维化形成的重要策略[20]。Ⅰ型和Ⅲ型胶原是ECM的主要成分，在肝纤维化时HSC是肝内ECM的主要来源，因此抑制HSC合成与分泌胶原能延缓肝纤维化的发生。本实验结果表明，RNA干扰能使细胞胶原表达显著下调。此外，抑制HMGB1表达的siRNA使培养上清液胶原含量明显降低。

siRNA HMGB1能明显减少细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成与分泌。因此，siRNA介导的HMGB1沉默可能对肝纤维化具有潜在的治疗前景。

【参考文献】

[1]Koichi S，Hiroya T，Akitoshi I，et a1.High-mobility-group box chromosomal protein 1 as a new target for modulating stress response. Surg Today，2010，40（4）：592-601.

[2]Ayse A，Muhammet HU，Serkan C，et a1.Is HMGB1 a new indirect marker for revealing fibrosis in chronic hepatitis and a new therapeutic target in treatment.Viral Immunol，2010，23 （6）：633-638.

[3]葛文松，吴建新，范建高.siRNA沉默高纤移率组蛋白B1表达对肝星状细胞生物学特性的影响.胃肠病学和肝病学杂志，2010，19（9）：804-807.

[4]Vogel S，Piantedosi R，Frank J，et al. An immortalized rat liver stellate cell line（HSC-T6）：a new cell model for the study of retinoid metabolism in vitro. J Lipid Res，2000，41（6）：882-893.

[5]Friedman SL. Hepatic fibrosis overview. Toxicology，2008，254（3）：120-129.

[6]Connolly MK，Bedrosian AS，Mallen-St Clair J，et al. In liver fibrosis，dendritic cells govern hepatic inflammation in mice via TNF-alpha. J Clin Invest，2009，119（11）：3213-3225.

[7]FriedmanSL.Mechanismsofhepaticfibrogenesis.Gastroenterology，2008，134（6）：1655-1669.

[8]Yang H，Hreggvidsdottir HS，Palmblad K，et al. A critical cysteine is required for HMGB1 binding to Toll-like receptor 4 and activation of macrophage cytokine release. Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（26）：11942–11947.

[9]Han J，Zhong J，Wei W，et al. Extracellular high-mobility group box 1 acts as an innate immune mediator to enhance autoimmune progression and diabetes onset in NOD mice. Diabetes，2008，57（8）：2118–2127.

[10]Kao YH，Jawan B，Goto S，et al. High-mobility group box 1 protein activates hepatic stellate cells in vitro. Transplant Proc，2008，40（8）：2704–2705.

[11]Gong Q，Zhang H，Li JH，et al. High -mobility group box 1 exacerbates concanavalin A-induced hepatic injury in mice. J Mol Med，2010，88（12）：1289-1298.

[12]Ilmakunnas M，Tukiainen EM，Rouhiainen A，et al. High mobility group box 1 protein as a marker of hepatocellular injury in human liver transplantation. Liver Transpl，2008，14（10）：1517-1525.

[13]Ge WS，Wu JX，Fan JG，et al.Inhibition of high-mobility group box 1 expression by siRNA in rat hepatic stellate cells. World J Gastroenterol，2011，17（36）：4152-4161.

[14]Hamada N，Maeyama T，Kawaguchi T，et al. The role of high mobility group box 1 in pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol，2008，39（4）：440-447.

[15]Castanotto D，Rossi JJ.The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics. Nature，2009，457（7228）：426-433.

[16]张莹，孔贺利，张建军，等. shRNA重组慢病毒沉默SMAD3对大鼠肝纤维化的抑制作用.实用肝脏病杂志，2014，17（3）：267-270.

[17]蒋玉凤，周德江，张建军，等.肝纤维化相关细胞因子双重RNA干扰质粒的构建及转染肝星状细胞研究.实用肝脏病杂志，2012，15（6）：516-519.

[18]Ying RS，Zhu C，Fan XG，et a1.Hepatitis B virus is inhibited by RNA interference in cell culture and in mice.Antiviral Res，2007，73（1）：24-30.

[19]George J，Tsutsumi M.siRNA-mediated knockdown of connective tissue growth factor prevents N-nitrosodimethylamine-induced hepatic fibrosis in rats.Gene Ther，2007，14（10）：790-803.

[20]Moreira RK.Hepatic stellate cells and liver fibrosis.Arch Pathol Lab Med，2007，131（11）：1728-1734.

（收稿：2015-01-14）

（本文编辑：陈从新）

·实验性肝炎·

Inhibition of small interfering RNA targeting high mobility group box chromosomal protein 1 on col-

lagen typeⅠandⅢin hepatic stellate cells in vitro

Ge Wensong，Fang Jiangao，Li Guangming. Department

of Gastroenterology，Xinhua Hospital，Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of synthetic small interfering RNA（siRNA）targeting high mobility group box chromosomal protein 1（HMGB1-siRNA）on collagen typeⅠandⅢin hepatic stellate cells （HSCs）in vitro. Methods Synthetic siRNA targeting HMGB1 was transfected into HSC-T6 cells by lipofectamine，and negative siRNA transfection and no transfection were used as negative control and blank control，respectively. After incubation with siRNA，total RNA and protein of HSC-T6 cells were extracted；the protein levels of typeⅠandⅢcollagen were determined by using Western blotting and immunofluorescence；Collagen type ⅠandⅢlevels in the supernatants were determined by enzyme linked immunosorbent assay. Results The expression of collagen typeⅠandⅢwere significantly reduced after transfection of HMGB1-siRNA compared with in control or blank. The levels of collagen type I and typeⅢin the supernatants of transfected cells were decreased than in the negative control at 72 hours；the 1evels of type I collagen decreased by（46.36±3.82）%（F= 33.14，P<0.01）and the 1evel of typeⅢcollagen decreased by（41.92±3.58）%（F=27.56，P<0.01）at 72 hours when compared to the control. Conclusion Inhibition of HMGB1 by siRNA decreases the synthesis and the secretions of typeⅠandⅢcollagen in HSCs and this might has a potential effect in prevention and treatment of hepatic fibrosis.

【Key words】Hepatic stellate cells；Small interfering RNA；High mobility group box chromosomal protein 1；Collagen

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.002

通讯作者：李光明，E-mail：ligm68@126.com

*基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81200279）