Nedd4L与肝纤维化发生关系的研究进展*

陈邦涛综述，赵中夫审校

Nedd4L与肝纤维化发生关系的研究进展*

陈邦涛综述，赵中夫审校

作者单位：046000山西省长治市山西医科大学长治医学院肝病研究所

第一作者：陈邦涛，男，26岁，硕士研究生。主要从事肝病的基础与临床研究。E-mail:1006626544@qq.com

【摘要】神经前体细胞表达发育调控样基因（Nedd4L）所编码蛋白属于泛素连接酶E3，其对胞内蛋白的泛素化和降解过程至关重要，涉及到Nedd4L的作用方式以及活化与调节。越来越多的研究提示Nedd4L与癌症、肥胖、高血压以及纤维化发生过程息息相关，但其具体机制不甚明确。本文将讨论Nedd4L的研究现状，并重点介绍Nedd4L与肝纤维化发生的关系研究进展。

【关键词】肝纤维化；神经前体细胞表达发育调控样基因；发生机制

神经前体细胞表达发育调控样基因（Neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like，Nedd4L）mRNA在肝、肾、肺、心脏组织中呈高水平。众多研究发现Nedd4L与人类多种疾病的发生发展及治疗转归息息相关。本文将对Nedd4L的作用方式、Nedd4L活化与调节、与人类疾病的关联、以及NEDD4L基因敲除的动物实验研究现状进行总结，并重点阐述其与肝纤维化发生的关系。

1　Nedd4　L的基因位点及作用方式的研究

Nedd4L位于人类染色体18q2l.31，其包含38个外显子，因而有多样化的Nedd4L—mRNA，在NCBI数据库中，至少有17种人类Nedd4L基因的异构体，但所有Nedd4L蛋白质均具相同的结构域（C2域+4个WW域+HECT域）[1]。Nedd4L可作用于上皮钠通道（Epithelial sodium channel，ENaC）、Na-Cl共转运体（NCC）、电压门控钠通道（Voltage-gated sodium channels，NAV）、钾离子通道（KCNQ）等。（1）ENaC是一个由三个亚基（α，β和γ）且具有两个跨膜区的异三聚体，功能正常的ENaC对维持体内钠平衡、维持血压、肺泡液的清除及气体的交换至关重要[2]。在体实验表明，Nedd4L的WW结构域可直接结合到ENaC三个亚基羧基末端的PY基序使ENaC泛素化而下调ENaC的表达[3]。（2）研究发现在SD大鼠肾小管细胞或培养中的mDCT细胞中缺失Nedd4L时可使NCC活性增加，有研究提示Nedd4L可与非洲爪蟾卵母细胞和转染细胞表面的NCC相互作用并使其泛素化从而使NCC表达减少、活性降低，但尚不清楚这两种蛋白质的相互作用方式，因为NCC无典型PY基序[4]。（3）NAV家族中有7个NAVs含有PY基序，可以与Nedd4L的3WW或4WW结构域相结合，在人胚肾细胞（Human Embryonic Kidney，HEK）中心脏NAv1.5可被Nedd4L的共表达抑制，有报道称Nedd4L可下调成年脊髓背根神经节神经元细胞表面的NAV，最新研究发现在神经性疼痛的动物模型中，Nedd4L下调或缺失将导致DRG神经元兴奋性增高[5，6]。（4）Nedd4L的共表达可影响心脏钾离子通道（KCNQ）α亚单位与KCNEβ亚单位组成的KCNQ/KCNE通道复合物，在体荷兰猪心肌细胞中催化灭活Nedd4L活性可增加KCNQ1电流，进一步研究发现在HEK239细胞中由于Nedd4L共表达的泛素化作用使KCNQ1水平降低，这种泛素化作用在非洲爪蟾卵母细胞和导管上皮细胞中已被证实[7，8]。最新体外实验研究发现，通过干扰与HERG（Human ether a go go related gene）钾通道相结合的Nedd4L结构域可完全消除毒蕈碱受体对HERG钾通道蛋白表达的影响，其Nedd4L是通过泛素化降解hERG钾通道[9]。（5）Nedd4L还可通过其WW结构域使胞膜RNA病毒（如HIV-1）的基质蛋白泛素化而降解或变异[10]。其它尚处于争议的作用物有氯通道、肺泡表面活性物质、EAAT1/2、巴胺转运体等。

2　Nedd4　L活化与调节

（1）.通过其WW域与HECT域的LPxY基序微弱结合的这种分子内交互作用可抑制其自身泛素化，LPxY基序突变可降低Nedd4L结合ENaC亚基并抑制ENaC的活性[11]。（2）.去泛素化的泛素特异性蛋白酶2-45（Deubiquitinase ubiquitin-specific protease DUB Usp2-45）：Usp2-45的催化域和N末端与Nedd4L的HECT域相互作用可降低非洲爪蟾卵母细胞ENaC的泛素化并增加其在细胞表面的表达[12]。（3）. Nedd4家族交互作用蛋白（NEDD4 family-interacting protein，NDFIP）适配器：现已在高尔基复合体、内涵体和多囊脂质体内发现NDFIP1、NDFIP2两种具有3个跨膜区和3个PY基序的适配器，通过NDFIP1，WWP2连接区和Nedd4L相互作用可调节二价金属离子转运体，而在神经元中高表达NDFIP1可促进Nedd4、Nedd4L、ITCH蛋白进入内涵体，最近发现NDFIP1/NDFIP2与水通道蛋白2（Water channel aquaporin 2，AQP2）的相互作用对Nedd4/Nedd4L泛素化AQP2并使其降解至关重要[13，14]。（4）. 14-3-3蛋白：14-3-3蛋白是一种广泛表达的结合在磷酸丝/苏氨酸基序的接头蛋白，研究显示14-3-3蛋白可与Nedd4L的磷酸丝氨酸结合而阻止目标蛋白间的相互作用，当蛋白激酶如血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶（Serum and glucocorticoid inducible protein kinase1，SGK1）和AKT磷酸化Nedd4L特定的丝氨酸残基后可促使14-3-3蛋白的结合，从而抑制Nedd4L的功能，SGK1不仅可磷酸化Nedd4L且本身也是Nedd4L的作用底物[15]。SGK是一种广泛存在于各种组织和细胞中的快速诱导的丝／苏氨酸蛋白激酶，它能够通过磷酸化影响目的蛋白的活性、稳定性、细胞内分布，而参与调节多条信号通路及细胞增殖、凋亡等多种细胞应答.

3　Nedd4　L与人类疾病的关联研究

既往研究证实Nedd4L与非小细胞肺癌、胃癌、预后较差的神经胶质瘤、结直肠癌、膀胱癌、Sezary综合征关系密切，最新研究发现，Nedd4L基因沉默可减缓培养中的黑色素瘤细胞生长，而Nedd4L过度表达可促进异体移植模型黑色素瘤细胞生长[16]，在胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中，Nedd4L通过miR21，miR23a and miR27a而减轻PDAC细胞的增殖[17]，在由Wnt/β-catenin信号引起的人肝细胞癌中，Nedd4L呈高水平表达[18]。rs4149601（G/A）基因移码突变造成编码蛋白截短，是Nedd4L基因的隐匿性剪切位点，功能研究表明此基因变异通过上皮钠通道通路（ENaC-Nedd4L-SGK1）可引起钠离子重吸收增加，从而在调节机体血压方面起重要作用，最新研究证实rs414960l A等位基因是高血压的危险因素（OR值：1.31，95%CI:1.11-1.55），体位性低血压的保护因素（OR=0.68，95%CI:0.48-0.98），并对氢氯噻嗪的降压效果更敏感（P<0.05）[19]。但一项对新疆哈萨克族人群的研究显示，rs414960l多态性与该人群中心性肥胖相关而与该人群高血压病不相关，D-C-G-C（296921-3delTTG/ rs2288774/rs2288775/rs4149601）单体型可能是该种族人高血压病的易感因素；rs3865418多态性与该人群中心性肥胖不相关，GG基因型可能是哈萨克族人群中心性肥胖的易感因素[20~22]。

4　Nedd4　L基因敲除的动物实验研究

在Shi et al[23]在大鼠研究中发现，Nedd4L基因敲除的大鼠可正常生长发育且具有正常寿命，但却表现出ENaC表达轻度增加以及轻微的盐敏性高血压，这表明Nedd4L对ENaC的调控至关重要并进一步证实了相关体外研究结果。而与Shi等人研究结果相反的实验[24]显示在C57B16纯遗传背景下，Nedd4L基因敲除大鼠模型显示出胎儿期或围产期致死性，同时在这些大鼠中也未检测到Nedd4L-mRNA和蛋白质，并且大多数大鼠由于肺泡塌陷以及在肺和肾脏中高表达ENaC而在出生前死亡，与ENaC高表达一致，在II型肺泡上皮细胞中也检测到ENaC电流增加，这极有可能是导致未成熟肺液清除障碍、肺泡充气受阻的原因；而虽有极少部分大鼠活到了22天，但也因在肺和肾脏中高表达ENaC以及严重的肺炎而死亡；Kimura et al[25]报道在大鼠肺上皮细胞中耗竭Nedd4L基因会导致一种以气道粘液排除受阻和严重炎症为特征的囊性纤维性样病变，显得尤其重要的是，在其研究中给予阿米洛利（ENaC抑制剂）可以挽救新生个体肺泡细胞的表型。在另一项[26]特异性诱导大鼠肾小管Nedd4L基因耗竭的实验中发现，当给予高钠饮食会显示出可被氢氯噻嗪（NCC抑制剂）纠正的高钙尿症和高血压，且伴随着NCC蛋白水平增加、β及γENaC和肾髓质K+通道的表达增加；特异敲除大鼠神经元细胞Nedd4L基因实验和在非洲爪蟾Nedd4L基因消融实验中[27～29]发现Nedd4L基因对于轴突的生长至关重要，其缺乏将导致轴突复杂性降低，然而Nedd4L基因是否通过泛素化途径调节轴突复杂性抑或通过Nedd4L基因的作用底物影响轴突尚不甚明确。最近一项在验证敲除Nedd4L基因的大鼠神经元细胞膜Nav.通道是否有畸变的实验中意外发现，在脊髓被根神经节和皮质神经元的Nav.通道表达如常，提示其不受Nedd4L基因调控。然而，Nedd4L基因随着细胞内Na+浓度增加而激活并且下调皮质神经元的Nav.通道，提示其如ENaC一样，Nav.通道蛋白也受Nedd4L蛋白泛素化作用、胞吞作用以及随后的细胞内降解作用而反馈抑制调节[30]。

5　Nedd4　L与肝纤维化的关系研究

在我国，各种末期肝病如肝硬化及肝癌已成为严重危害人类生命健康的医学问题。肝纤维化是慢性肝脏疾病进展至肝硬化甚至肝衰竭、肝癌的共同病理过程，近年来的大量临床和实验研究表明，肝纤维化是可逆性病理过程[31]。肝纤维化的基本病理特征为细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）合成增多和降解相对不足，而在肝内大量堆积[32，33]，而对其发生发展的机制及其防治的研究已成当今医学界防治肝硬化的热点。肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）仍然被认为是ECM的主要来源细胞[34]，由于HSC的激活是肝纤维化发生发展中的一个关键事件，所以研究HSC的激活对探索肝纤维化发生机理及抗肝纤维化的有效防治均有特别重要的临床意义[35]。目前公认的最重要的促肝纤维化细胞因子当属血小板源性生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）和转化生长因子β（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）[36]，其对HSC活化、增殖、转化的调节起关键作用。另外，HSC转化为肌纤维母细胞（Myofibroblast，MFB）后除可以产生大量以胶原为主的ECM成分外，又能通过自分泌和旁分泌方式产生TGF-β1等细胞因子维持肝纤维化的发展[37]。因此, TGF-β1对H S C的激活、转化、分化及调节具有极其重要的作用。

已经发现调控肝纤维化的细胞内信号通路主要有:（1）. TGF-β-Smad信号通路。（2）. PDGF信号通路（Ras/ERK信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶PI-3K信号通路、JAK/STAT信号通路）。（3）. FAK、PI3K/Akt信号通路。（4）.核因子-κB （NF-κB）信号通路。（5）. TLR信号通路。（6）.整合素（Integrin）信号通路。（7）. Wnt信号通路。（8）. Hedgehog（Hh）信号通路。（9）. Rho-Rock信号通路。（10）.血管紧张素Ⅱ信号通路。（11）.氧化应激、ROS信号通路。既往大量研究已经证明TGF-β1/Smad信号通路仍是产生ECM最主要的信号通路[38，39]。基本的TGF-β1/Smad信号转导系统为：首先由TGF-β结合到HSC表面TGFβ受体Ⅱ（TβRⅡ），再活化TβR I，然后再磷酸化而激活RSmad（Receptor -phosphorylated SMADs，RSmad）。RSmad蛋白包括Smad1、2、3、5、8，其中主要传递蛋白是Smad2和Smad3。p-Smad2、3与CoSmad （Common mediater Smads，Co-Smads）蛋白Smad4形成活性的转录复合物进入核内，与核协同或抑制因子结合，调节目的基因的转录。Smad6和Smad7可以负性调节这一传导过程，被称为ISmad（Inhibitory Smads，I-Smads）[40]。其中Smad3是主要促进HSC产生组织纤溶酶抑制物（PAI-1）及I型胶原蛋白（Collagen I）的蛋白。PAI-1可通过抑制纤溶酶和基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）的活性，进而抑制ECM的降解。有研究表明缺失Smad3的小鼠可以抵抗DMN、CCL4或TAA诱导的肝纤维化，说明Smad3是Smad信号通路中起决定作用的蛋白。近几年研究发现泛素-蛋白酶体途径（Ubiquitin-proteosome pathway，UPP）可通过泛素化降解Smads蛋白而调控TGF-β1/Smad信号通路。

UPP是目前己知的所有真核生物体内具有高度选择性的最为重要的胞内蛋白降解的主要途径，是由泛素、泛素连接酶（Ubiquitin activating enzyme）、26S蛋白酶体和泛素再循环酶组成。泛素连接酶包括泛素活化酶E1、E2、E3，其中泛素连接酶E3在识别靶蛋白及随后的蛋白质降解中起关键作用[41]。现已发现鉴定的泛素连接酶E3主要有三大类: HECT结构域家族、RING结构域家族和U-box蛋白家族，其中主要的是HECT E3，它可以通过调节靶蛋白的泛素化，影响靶蛋白的活性、定位以及蛋白质结构的改变，而参与细胞的信号传导、基因转录、细胞分裂和分化等许多过程的调节[42]。Zhang等2001年首先发现降解Smad1、2、7的E3泛素连接酶Smurf（Smad ubiquition regulatory factor），揭示Smads蛋白降解受UPP调控。

Nedd4L编码蛋白也即E3泛素连接酶，属UPP途径的重要成分，Nedd4L调节TGF-β1的信号通路的研究不尽统一。Kuratomi et al[43]发现Nedd4L通过Smad7（含PY基序）下调TGF-β1受体并通过泛素化使该受体降解，且Nedd4L 在HepG2细胞过度表达可使TGF-β信号肽的表达降低，而沉默Nedd4L可增加TGF-β信号肽的表达，进一步研究发现Nedd4L是通过泛素化降解Smad2调节该过程。最近Gao et al[44]发现在人胚肾细胞HEK293T中Nedd4L还可通过泛素化降解磷酸化Smad3，而限制TGF-β1的信号通路。用蛋白酶体抑制剂MG132或RNAi技术抑制Nedd4L活性或减少其表达，均能增加TGF-β1诱导的磷酸化Smad2/3和PAI-1的表达。有文献报道Nedd4L与其他激酶不同，在静息细胞中具有活性，可对靶蛋白维持泛素化状态；而当其自身被磷酸化时，就失去酶活性，解除对靶蛋白的泛素化[45]。

有研究发现SGK可通过磷酸化而调控Nedd4L活性。比如Debonneville[46]发现在卵母细胞中SGK可以使Nedd4L发生磷酸化，而失去降解上皮Na离子通道ENaC的能力，增加ENaC。Flores[47]在体外用醛固醇刺激小鼠mpkCCDcl4细胞，发现醛固酮能增加p-Nedd4L、SGK表达及ENaC数量。在切除肾上腺的大鼠肾组织中同样发现p-Nedd4L、SGK表达及ENaC数量增加。Dieter et al[48]将SGK质粒转入卵母细胞发现SGK可以增加高糖诱导的p-Nedd4L和Na（+）高糖运载体SGLT1表达。Gao实验发现由TGF-β1激活的Smad3的活性的50%可被Nedd4L抑制，并通过转染HEK293T细胞SGK质粒，发现SGK可以磷酸化Nedd4L，阻止Nedd4L与Smad3结合，减少Smad3的泛素化。而且一些临床和实验室证据已表明，慢性病毒性肝炎肝硬化、肺纤维化、糖尿病肾病患者病变组织中SGK表达较正常人明显增高[49，50]。Fillon[51]转染HepG2细胞具有正常活性野生型SGK质粒和突变体SGK质粒，结果发现H2O2可以增加转染野生型SGK的HepG2细胞纤维连接素（fibronectin，FN）表达,而不增加转染突变体SGK的FN表达；Feng将SGK野生型和突变体转染肾小球系膜细胞（HMC），同样发现高糖可以增加转染野生型SGK质粒的FN表达,而不能增加转染突变体SGK质粒的FN表达。这些结果均提示Nedd4L和SGK可能参与肝纤维化的发生。

6　展望

本文主要总结了近些年Nedd4L在动物模型中的相关研究，其中研究最明确的是对ENaC的影响，而对其他如调节肝纤维化的TGF-β1的信号通路的作用方式不甚明确，且在动物模型中的相关研究甚少。在今后的研究工作中，若能明确Nedd4L对肝纤维化发生发展的作用机制，有望为以Nedd4L为靶点的肝纤维化的防治提出新的理论依据。

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（收稿：2015-04-28）

（本文编辑：张骏飞）

·综述·

Fibrogenesis of neural precursor cell- expressed developmentally down- regulated gene 4- like gene in liver fibrosis

Chen Bangtao，Zhao Zhongfu. Institute of Liver Diseases，Changzhi Medical College，Shanxi Medical University，Changzhi 046000，Shanxi Province，China

【Abstract】Protein encoded by neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like（Nedd4L）gene belongs to the ubiquitin ligase E3. Tt is important for ubiquitination and degradation process of intracellular proteins，which involves in the action mode，activation and regulation of Nedd4L. More and more researches points out that cancers，obesity，hypertension and fibrosis are closely related to action of Nedd4L，but the specific mechanisms are far from clear. This review focuses on the fibrogenesis of Nedd4L in liver fibrosis.

【Key words】Liver fibrosis;Neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like gene；Fibrogenesis

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.030

通讯作者：赵中夫，E-mail:zhaozf_1226@163.com

*基金项目：长治医学院科技创新团队项目（编号：CX201404）