金水鲜冻干粉悬液联合顺铂对宫颈癌C-33A细胞的生物学影响

宋 建 戈 伟 刘 梁

武汉大学人民医院肿瘤Ⅱ科，湖北武汉 430060

子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，手术和放疗作为局部治疗不能控制子宫颈癌的亚临床病灶，导致中、晚期子宫颈癌的治疗效果较差，而化疗作用于全身组织器官杀灭肿瘤，通过特殊的给药方式还可以提高药物的局部浓度，以顺铂为基础的联合化疗具有重要的抗宫颈癌活性[1-2]，有报道单独使用其反应率达23%～50%[2-3]，顺铂作为细胞周期非特异性抗癌药物[4]，对肿瘤细胞的抑制作用较强，但是毒副作用较大。 金水鲜作为国家自主研发的中药，承合传统的中医扶正荡邪理论，经济且低毒，本课题组前期研究发现金水鲜冻干粉能够增强对铂类药物敏感的肺癌细胞的增殖抑制和促进细胞凋亡[5-6]，是否同样会增强对铂类药物敏感的宫颈癌细胞的杀伤作用不得而知，因此本研究联合使用金水鲜冻干粉以及顺铂观察对宫颈癌细胞产生的生物学影响，以分析其是否对宫颈癌细胞化疗效果有增强作用，为将来临床的联合用药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株及试剂

人源宫颈癌C-33A 细胞株：购自美国ATCC。 临床用金水鲜冻干粉（北京建生药业有限公司惠赠，批号：20140821），分装成浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL的药物悬液。 取0.3 mg 顺铂（云南生物谷药业股份有限公司， 批号：H39021357） 溶解于0.9%氯化钠溶液10 mL 中，配成终浓度30 μg/mL 溶液。 主要实验试剂有RPMll640 培养液 （GIBCO）、 胎牛血清（GIBCO）、CCK-8 试剂盒 （北京世纪康为世纪生物科技有限公司）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所，C230）、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单抗（Santa Cruz 公司，美国）、p21 一抗（Santa Cruz 公司，美国）、p53 一抗（Santa Cruz 公司，美国）、HRP-羊抗兔IgG（Santa Cruz 公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 宫颈癌C-33A 细胞培养于含10%FBS（胎牛血清）的RPMI l640 培养液，置于CO2培养箱，37℃静置培养， 细胞培养2～3 d 后换液，5～7 d 后进行传代， 用培养液将细胞数调整为实验所需密度，向6 cm 培养皿中加入5 mL 完全培养基， 细胞传代时向管中加入80 μL 台盼蓝溶液，显微镜下细胞计数板计数，同时判断细胞密度及存活率，细胞状态处于对数生长期时进行实验。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞增殖-毒性 在96 孔板中配置100 μL 的宫颈癌单细胞悬液， 每孔约2500 个细胞，将培养板在培养箱预培养24 h（37℃，5% CO2），向培养板加入10 μL 不同浓度（0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL）的药物混合液（实验组），将96 孔板在培养箱孵育24 h，每孔加10 μL CCK 溶液后，继续孵育1 h，避光的条件下，24 h 内测定使用酶标仪测定吸光度（A），CCK-8计算各药物作用12、24、48 h 和96 h 后对肿瘤细胞增殖抑制率，增殖抑制率（%）=（对照组A 值-实验组A值）/对照组A 值×100%， 使用CCK-8 筛选最佳金水鲜单药抑制浓度，进而计算联合药物金水鲜冻与顺铂处理后对宫颈癌细胞的增殖抑制效率。

1.2.3 Western blot 检测各组蛋白表达情况 蛋白样品制备，①对照组：向培养液中加入1 mL 0.9%氯化钠溶液作为对照组。 ②金水鲜组：向培养液中加入0.5 mg/mL 浓度的金水鲜冻干粉注射液1 mL。③顺铂组：根据以往文献报道，顺铂药物浓度设定为30 μg/mL，每10 厘米培养液中加入顺铂混悬液1 mL。 ④金水鲜联合顺铂组，剂量同②、③，同时加入培养基中处理；于第48 小时收集细胞。 采用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定，制备10%分离胶和5%浓缩胶灌注，电泳缓冲液中80 V 电泳，170 mA 恒流转膜2 h，5%脱脂奶粉中封闭，一抗孵育4℃缓慢摇动过夜。第2 天加入二抗孵育液，室温湿盒中孵育2 h，之后于生物发光影像分析仪扫描成像。

1.2.4 PI 染色检测各组细胞周期变化 4℃条件下，1500 r/min 离心5 min 后收集细胞， 弃上清， 用预冷PBS 洗细胞两次，预冷的70%乙醇于-20℃固定过夜，次日4℃，1500 r/min 离心5 min 后收集细胞， 继续以每管1 mL 的PBS 洗细胞1 次，再加入500 μL PBS 含50 μg/mL 溴化乙锭（PI）细胞染色，100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30 min，上机进行流式分析，一般计数2 万～3 万个细胞，结果用细胞周期拟和软件Modfit 分析。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK8 法检测细胞增殖活力

从图1 中看出， 宫颈癌细胞使用金水鲜冻干粉0.1、0.2 mg/mL 处理12、24 h 后， 抑制活性均较低，具有时间梯度依赖性的肿瘤细胞增殖抑制效果， 另外，从图1 中还显示出金水鲜药物浓度梯度依赖性对宫颈癌C-33A 增殖活力的影响， 尤其在在处理48 h时，药物浓度为0.5 mg/mL 的条件下，二者可以协同发挥最大效果的抑制细胞增殖效率并达到61.2%，然而继续增加浓度， 并不能继续提高细胞抑制效率，考虑药物浓度的饱和作用影响了更高药物作用的发挥，与0.1、0.2 mg/mL 金水鲜组比较 （19.8%比37.6%），差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。如图2 所示，为了证明筛选出的合适的最佳药物处理浓度具有更好的协同增效作用， 本研究采用0.5 mg/mL 金水鲜冻干粉联合顺铂30 μg/mL 继续进行CCK-8 实验，联合药物在处理48 h 后上机检测， 金水鲜联合顺铂组对细胞的抑制率达82.05%，与单用金水鲜（52.41%）比较，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），而与单独的化疗药物顺铂作用效果（65.24%）比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），提示在一定程度范围内，金水鲜冻的药物悬液可以明显增加顺铂的药物效力。

图1 不同浓度金水鲜冻干粉处理宫颈癌C-33A 细胞不同时间点抑制率比较

2.2 各组宫颈癌C-33A 细胞胞p53、p21 等蛋白表达量的比较

金水鲜联合顺铂组细胞周期相关蛋白p53、p21在实验因素处理48 h 后表达明显上调， 较金水鲜组和对照组效果明显（P ＜0.05）。 见图3、表1。

2.3 各实验处理组的细胞周期变化

图2 不同药物处理48 h 后宫颈癌C-33A 细胞增殖抑制率比较

图3 各组宫颈癌C-33A 细胞p53、p21、GAPDH 表达情况

表1 各组p53、p21、GAPDH 蛋白表达水平比较（）

表1 各组p53、p21、GAPDH 蛋白表达水平比较（）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与金水鲜组比较，#P ＜0.05；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶

组别 p21 p53 GAPDH对照组（n=3）金水鲜组（n=3）顺铂组（n=3）金水鲜联合顺铂组（n=3）5679±445 7973±451 13 534±425 27 165±435*#5432±335 6878±395 12 334±362 22 105±373*#11 231±214 11 032±185 11 187±395 10 985±275

金水鲜联合顺铂组细胞周期的分布在实验因素处理48 h 后呈明显差异，其中细胞在G1期明显阻滞（55%），较金水鲜组（45%）和对照组（37%）效果明显（P ＜0.05），考虑金水鲜对肿瘤细胞的抑制可能是通过对细胞周期的阻滞实现的。 见图4。

3 讨论

宫颈癌占的发病率女性生殖系统恶性肿瘤的半数以上，呈逐年上升趋势，趋于年轻化[7]，早期的时候主要通过手术治疗， 在中晚期的时候主要通过放化疗，但疾病的治疗效果依然没有显著性提高，顺铂是临床上妇科恶性肿瘤最主要的抗癌药物[8]，随着疗效的凸显，剂量限制性毒性主要为肾毒性[2,9]，使用顺铂的患者会出现显著的尿微量蛋白升高，前期的研究发现金水鲜可以改善患者的恶性肿瘤症状，减轻不良反应，缩短机体免疫恢复造血能力恢复的时间，这些优点为临床联合使用顺铂为基础的化疗提供了可能性[10]。

图4 各组处理48 h 后的细胞周期分布

金水鲜作为天然类药物，是中国癌症研究基金会北京鲜药研制中心与清华大学生命科学与工程研究院共同研制的鲜动植物药剂，提取鲜蛤蚧、鲜金钱白花蛇、冬虫夏草、鲜西洋参等药品中的高效抗癌生物活性物质入药，近年来的研究及临床应用表明多靶点地针对DNA 损伤修复， 还可以阻滞肿瘤细胞S 期分裂，从祖国传统医学上讲其适用于气阴两虚、肺肾不足所致的病症。传统临床用于肺癌患者及化疗的合并用药[11]。 既往已有的基础实验研究证明其可能通过增强迟发超敏反应、调节T、B 细胞增殖、刺激肿瘤坏死因子分泌等途径提高机体的免疫功能，从而增强了机体自身的抗肿瘤能力，显著地抑制肿瘤细胞；其次金水鲜通过对抗化疗副作用，产生减毒增效的作用[6,12]。

已有的研究报道在体外动物实验表明，金水鲜联合放疗对肺癌等实体瘤的生长有放疗协同作用[12]，本研究中主要通过顺铂联合金水鲜药物悬液在宫颈癌细胞体外实验的形式，通过绘制肿瘤细胞增殖抑制率曲线，观察到在不同浓度金水鲜悬液作用下，宫颈癌细胞的倍增活力较对照组明显减慢，并且随着剂量的递增，对细胞生长能力的抑制作用亦呈增强趋势并存在着剂量效应关系[6,13]。 故从金水鲜的浓度梯度和时间梯度方面证实其单独抑制癌细胞增殖的有效性，选取了适合体外细胞联合治疗的浓度和时间，进一步验证金水鲜联合顺铂药物对宫颈癌细胞的增殖抑制协同作用以及分析其协同作用的可能机制，取得了比较好的研究结果。

研究发现， 不论单用化疗药物还是单用抗癌鲜药，都较强地抑制了癌细胞的增殖活力，考虑在机制协同方面有相互的促进作用，随后本研究通过流式细胞仪的检测分析和蛋白免疫印迹实验找到了可能的协同机制。

一个细胞周期包括有丝分裂期（M）和分裂间期（G1、S、G2），流式细胞仪分析细胞周期各时相中，宫颈癌C-33A 细胞在药物处理后，S～G2期所占比例较对照组减少，G1时相增加，实验镜下观察过程中本研究通过高倍显微镜观察金水鲜悬液作用下的宫颈癌细胞，核质比例减小，表明单用金水鲜或联合顺铂后对肿瘤细胞的DNA 合成早期以及细胞复制所需要的蛋白质成分有明显的阻断作用。 通过对宫颈癌C-33A细胞细胞周期的凋亡趋势分析看到， 与对照组比较，使用化学药处理的细胞未出现明显的sub-G1峰，提示细胞的凋亡并不明显， 但是在DNA 复制晚期S 期的细胞所占比例明显低于对照组，说明在本实验药物作用下， 肿瘤细胞的DNA 合成晚期是药物主要的作用靶点，从而导致肿瘤细胞的增殖分裂减慢。

众所周知， 细胞周期进程中有3 个检查点，即G1～S、S～G2、G2～M 的过渡[14-15]。 在这3 个检查点上，基因及其蛋白产物调控着细胞周期进程[16]。 p53 蛋白在G1～S 过渡中起关键作用[10]。 p2l 蛋白中p53 下游基因的蛋白产物，是周期素依赖性蛋白激酶抑制剂[17]，本实验证实金水鲜药物悬液和顺铂药物联合处理，能够改变实验细胞株细胞周期的分布形式， 呈现明显的G1期阻滞， 而于细胞周期相关的蛋白如p21、p53 蛋白等则呈现明显的积聚。考虑联合药物处理可能为未来的妇科肿瘤的临床治疗提供一定程度的借鉴[11,18]。

金水鲜通过调节机体的平衡来提高其抗肿瘤效果，符合现代肿瘤生物治疗新模式，是否还存在其他的细胞信号通路仍需要进一步实验验证[19]，以及在对宫颈肿瘤细胞侵袭和转移方面的生物学影响仍然需要研究其和肿瘤表型之间的关系[20-22]，下一步拟开展更详细的计划，为临床合理科学地使用中成药联合现代化疗药物提供理论依据。

综上所述，本实验从细胞及分子生物学水平证实了以金水鲜为主要成分联合传统的化疗药物治疗宫颈癌细胞恶性表型的可能性，实验结果确实证实其协同抑制肿瘤细胞的作用，但仍需在动物模型上进行组织细胞学的验证和重复。

[1] 张晓霞，刘萍，郭海荣.宫颈癌新辅助化疗的临床应用及其疗效的评价[J].中国医学创新，2014，11（4）：144-146.

[2] 谢晶，白军，陈忠东，等.宫颈癌化疗的研究进展[J].肿瘤药学，2011，1（5）：405-408.

[3] 吴喆.评价宫颈癌预后生物学指标的最新进展[J].岳阳职业技术学院学报，2013，28（5）：91-95.

[4] 张秀玲，曲群，王桂贤，等.顺铂联合土贝母皂苷甲对宫颈癌Hela 细胞的增殖抑制作用研究[J].现代肿瘤医学，2010，18（10）：1909-1912.

[5] 张卫平，戈伟，刘梁.金水鲜联合放疗对A549 细胞血管生成及凋亡相关蛋白表达关系的研究[J].中国医药导报，2014，11（19）：12-16.

[6] 罗顺祥，戈伟，刘梓良，等.金水鲜胶囊联合放射治疗对肺腺癌A549 细胞HIF-1α 和EGFRmRNA 表达的影响[J].中国肿瘤，2013，（10）：830-833.

[7] 周雯娟.宫颈癌治疗后患者生活质量与性生活状况的研究[D].长沙：中南大学，2012.

[8] Li X，Zhou J，Huang K，et al. The predictive value of serum squamous cell carcinoma antigen in patients with cervical cancer who receive neoadjuvant chemotherapy followed by radical surgery：a single-institute study[J].PLoS One，2015，10（4）：e122361.

[9] Nedovic J，Protrka Z，Ninkovic S，et al.Cisplatin monotherapy with concurrent radiotherapy versus combination of Cisplatin and 5-fluorouracil chemotherapy with concurrent radiotherapy in patients with locoregionally advanced cervical carcinoma [J]. J BUON，2012，17（4）：740-745.

[10] 高益民，李建生.蛋白质组学与中药“鲜药”研究[Z].厦门，2009：5.

[11] Yang J，Li J，Sun M，et al. Studies of traditional Chinese medicine monomer on HeLa cell of cervical cancer [J].Pak J Pharm Sci，2014，27（4 Suppl）：1063-1068.

[12] 徐慧琳，戈伟，刘梁，等.金水鲜胶囊联合放射治疗对Lewis 肺癌小鼠肿瘤生长和血管内皮生长因子表达影响的研究[J].生物医学工程与临床，2014，（2）：172-177.

[13] 张卫平，戈伟，刘梁.金水鲜联合放疗对A549 细胞血管生成及凋亡相关蛋白表达关系的研究[J].中国医药导报，2014，11（19）：12-16.

[14] Granier CJ， Wang W，Tsang T，et al. Conditional inactivation of PDCD2 induces p53 activation and cell cycle arrest [J]. Biol Open，2014，3（9）：821-831.

[15] Huang X，Zhang S，Qi H，et al. JMJD5 interacts with p53 and negatively regulates p53 function in control of cell cycle and proliferation [J]. Biochim Biophys Acta，2015，1853（10 PtA）：2286-2295.

[16] Dutto I，Tillhon M，Cazzalini O，et al. Biology of the cell cycle inhibitor p21 （CDKN1A）：molecular mechanisms and relevance in chemical toxicology [J]. Arch Toxicol，2015，89（2）：155-178.

[17] Liu X，Yang WT，Zheng PS. Msi1 promotes tumor growth and cell proliferation by targeting cell cycle checkpoint proteins p21，p27 and p53 in cervical carcinomas [J].Oncotarget，2014，5（21）：10870-10885.

[18] Pesee M，Kirdpon W，Puapairoj A，et al. Palliative treatment of advanced cervical cancer with radiotherapy and thai herbal medicine as supportive remedy-analysis of survival [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（3）：1593-1596.

[19] Shen K. Prevention and management of cervical cancer promoted by value-based medicine [J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2010，90（43）：3025-3026.

[20] 冯刚，李亚强，安晓智，等.维生素C 联合顺铂与单药顺铂对Hela 细胞生长状况影响的比较[J].吉林医药学院学报，2011，32（4）：195-197.

[21] 张秀玲，曲群，王桂贤，等.顺铂联合土贝母皂苷甲对宫颈癌Hela 细胞的增殖抑制作用研究[J].现代肿瘤医学，2010，18（10）：1909-1912.

[22] 孔祥玲，吴维光，佘野，等.RNA 干扰HDAC1 提高人宫颈癌HeLa 细胞化疗敏感性研究[J].临床误诊误治，2015，28（1）：108-112.