RNA干扰沉默USP22基因对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响

廖志伟 庄雅靖 余宏伟 喻 芳 刘孟忠 周同冲

1.广州医科大学附属肿瘤医院放疗科，广东广州 510095；2.中山大学肿瘤防治中心放疗科，广东广州 510060

泛素特异性肽酶22（ubiquitin-specific processing peptidase 22， USP22）属于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用。USP22 编码产物在人类各种正常组织中呈现低丰度表达，在许多恶性肿瘤细胞中呈高丰度表达[1]。由于其在实体瘤中的特异性分布，可以作为肿瘤治疗的新靶点。

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术作为一种干预基因表达的实验工具已广泛用于抗肿瘤的研究。 慢病毒载体介导的基因表达或RNAi 作用持续且稳定，其作为新一代高效表达载体推进了肿瘤的基因治疗研究。 本研究将CNE-2 细胞， 转染对照质粒的CNE-2 稳定细胞株， 转染sh-USP22 质粒的CNE-2稳定细胞株，于动物背部行皮下注射，观察其对裸鼠移植瘤成瘤的影响， 旨在研究USP22 沉默后的体内抗肿瘤效应。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞：正常CNE-2 细胞，购自中南大学湘雅中心实验室， 培养及保存在广州永诺生物科技有限公司。本实验室前期研究以pLL3.7 质粒为载体，USP22 shRNA 序列靶点引自本课题组前期实验靶序列[2-3]，针对USP22 的编码序列设计的干扰序列如下：

sh-USP22 组：5'-AACTCACGGACAGTCTCAACAATTTCAAGAGAATTGTTGAGACTGTCCGTGTTTTTTC-3'； 3'-TTGAGTGCCTGTCAGAGTTGTTAAAGTTCTCTTAACAACTCTGACAGGCACAAAAAAGAGCT-5'。 阴性对照组：5'-AACTTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC-3'； 3'-TTGAAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTAAAAAAGAGCT-5'。

正常CNE-2（阴性对照），CNE-2 空载体细胞（Scrambled），USP22 表达下调稳定细胞株（sh-USP22），3 种细胞用含10%胎牛血清（GIBCO）的RPMI 1640 培养液（GIBCO）培养于CO2体积分数为5%的37℃的培养箱中。

实验动物：6 周龄、雌性、SPF 级BALB/c 裸鼠9 只，购于中山大学实验动物中心。 动物合格证编号：No.44008500006768，饲养于中山大学实验动物中心。 在无特殊病原条件（SPF）下饲养，饲料及水均自由摄入且经过严格的灭菌处理。

1.2 裸鼠体内成瘤实验方法

取对数生长期细胞，消化后，PBS 重悬离心，去除血清，最后将细胞重悬于PBS 溶液中，调整密度为5×107个/mL。 100μL 细胞悬液，于动物右侧背部行皮下注射。

实验分组：阴性对照组，CNE-2 空载体细胞株组（Scrambled 组），USP22 表达下调稳定细胞株组 （sh-USP22 组），每组3 只裸鼠。从第2 周开始每周测量肿瘤体积变化，第8 周结束实验，断颈处死裸鼠，剥取肿瘤，称重，冻存备用。 根据公式V=1/2（a×b2）计算肿瘤体积（V 代表瘤体积，a 为长径，b 为短径）。

1.3 RT-PCR 检测USP22 mRNA 的水平

按照Trizol 试剂说明书（Invitrogen 公司）提取肿瘤组织的总RNA，采用Promega 公司的M-MLV 逆转录酶进行逆转录反应， 用RT-PCR Quick Master Mix（Toyobo 公司）进行PCR 反应。

以Primer 5.0 软件设计引物，委托英骏生物技术有限公司合成，引物序列如下：

USP22-F：5'-CCATTGATCTGATGTACGGAGG-3'；USP22-R：5'-TCCTTGGCGATTATTTCCATGTC-3'；GAPDH-F：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'；GAPDH-R：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

反应体积包括：正反引物各1 μL，cDNA 产物1 μL，Taq 混合物25 μL，去RNA 酶去离子水22 μL，震荡混匀后放入PCR 仪中，调整好反应程序。 执行扩增。一般： 在93℃预变性3～5 min， 进入循环扩增阶段：93℃40 s→58℃30 s→72℃60 s， 循环30～35 次，最后在72℃时保温7 min。 PCR 产物于4℃保存待电泳检测。 PCR 产物在质量分数为2%的琼脂凝胶中，80 V恒压电泳30 min，在凝胶图像成像系统观察结果。 记录结果并进行灰度分析。 选取GAPDH 做内参，采用灰度分析计算USP22 相对表达量。

1.4 免疫组化检测USP22 蛋白的表达

分离得到的肿瘤用甲醛固定、组织包埋、石蜡切片、经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、热抗原修复。 分别检测各组织切片中USP22 的表达，具体步骤按VECTASTAIN ABC Kit （Vector laboratories 公司）试剂盒的说明书进行。 一抗为1∶200 兔抗人USP22 抗体（ab71732，Abcam 公司）， 二抗为羊抗兔IgG 抗体-HRP多聚体。上述各步骤间用PBS 缓冲液洗片3 次、DAB 显色、苏木精复染、光镜下观察结果。将细胞浆内棕黄色颗粒超过肿瘤细胞浆体积1/4 者计为阳性细胞，统计500 个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞百分比。

2 结果

2.1 裸鼠皮下移植瘤的生长情况及生长曲线测定肿瘤的生长

通过测量肿瘤长短径计算肿瘤体积，绘制出3 组皮下瘤生长曲线。 肿瘤生长曲线显示，sh-USP22 组肿瘤体积明显小于阴性对照组和Scrambled 组， 随着接种时间的延长，差异越来越明显。 见表1。

表1 各组裸鼠肿瘤体积的变化（mm3，）

表1 各组裸鼠肿瘤体积的变化（mm3，）

组别 第3 周 第4 周 第5 周 第6 周 第7 周 第8 周第2 周只数阴性对照组Scrambled 组sh-USP22 组333 124.25±11.82 114.05±10.26 104.35±9.39 280.65±19.64 236.25±14.17 168.05±14.28 578.05±63.58 448.05±49.28 245.25±26.97 815.00±73.35 749.65±89.96 321.45±32.14 1208.45±120.85 985.35±86.71 434.85±36.53 1426.05±171.13 1255.45±100.43 501.75±48.67 1651.55±214.70 1448.00±188.24 589.00±64.79

终点时间第8 周断颈处死裸鼠后剥离瘤体，sh-USP22 组肿瘤重量（0.54±0.07）g 明显小于阴性对照组（1.58±0.24）g 和Scrambled 组（1.46±0.23）g，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），见图1。

图1 鼻咽癌细胞株CNE-2 裸鼠移植瘤生长曲线和瘤体比较

2.2 半定量RT-PCR 检测USP22 mRNA 水平的变化

获取肿瘤后，进行半定量RT-PCR，以琼脂糖电泳条带的亮度来判断USP22 mRNA 水平高低。 sh-USP22 移植瘤组织出现很弱的特异性条带，而阴性对照组和Scrambled 组移植瘤组织条带明显较亮。 以GAPDH 为参照基因，分析凝胶成像图像的灰度值，将获得的目的基因灰度与参照基因灰度的比值作为表达量。 结果分析表明， 以阴性对照组表达量为参照（1），sh-USP22 组肿瘤组织中USP22 mRNA 相对表达量（0.14±0.09）低于阴性对照组和Scrambled 组（0.92±0.11），差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；而阴性对照组和Scrambled 组（0.92±0.11）比较，差异没有统计学意义（P ＞0.05）。

图2 半定量RT-PCR 检测3 组裸鼠移植瘤组织中USP22 mRNA 的表达

2.3 免疫组织化学法检测移植瘤内USP22 蛋白表达的变化

USP22 蛋白染色阳性为深黄色或棕黄色，主要位于细胞质内。 免疫组化染色后可见阴性对照组和Scrambled 组裸鼠皮下移植瘤组织中有较多棕黄色颗粒，细胞胞质中可见明显棕黄色染色。而sh-USP22 组裸鼠皮下移植瘤中，阳性染色细胞减少，细胞浆内着色颗粒明显少于阴性对照组和Scrambled 组， 包浆黄色明显减弱、变浅，表明注射pLL-shRNA 后人鼻咽癌裸鼠移植瘤中的USP22 蛋白表达下降。 见图3（封三）。

图3 免疫组织化学法检测移植瘤组织中USP22 的表达情况（200×）

将细胞浆内棕黄色颗粒超过肿瘤细胞浆体积的1/4 者计为阳性细胞，统计500 个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞百分比。 sh-USP22 组（12.45±1.16）%肿瘤组织中USP22 阳性细胞所占比率明显低于阴性对照组（97.25±1.94）%和Scrambled 组（91.28±2.75）%，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；阴性对照组（97.25±1.94）%和Scrambled 组 （91.28±2.75）%比较，差异没有统计学意义（P ＞0.05），表明USP22 表达明显降低，USP22 shRNA 抑制了USP22 的表达。见图4。

3 讨论

鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤，放射治疗是鼻咽癌最主要的治疗方法[4-5]。转移仍是鼻咽癌治疗失败的主要原因[6]。阐明鼻咽癌发生的分子机制，从而采取有效的干预措施控制转移一直是鼻咽癌研究的重点。 随着分子生物学技术的发展，从基因水平调控肿瘤的生长成为科学家们的重点研究方向。

图4 各组USP22 阳性细胞所占比率

Glinsky 等[7]通过mRNA 微集阵列技术在多种癌组织中研究证明了一组包含11 个基因的癌死亡标签，USP22 作为其中一员而引起高度关注。 人类USP22 基因定位于人17 号染色体上，由14 个外显子组成，其编码蛋白表达于细胞核，具有去泛素化的作用，可以使泛素从复合物中脱离。 USP22 通过去泛素化修饰达到调节细胞周期和促进肿瘤增殖的作用，其作为细胞信号网络中的枢纽分子很可能是多种细胞癌变、浸润的重要环节之一[8-11]。

文献发现USP22 在多数恶性肿瘤细胞中表达普遍升高，并且其表达水平与结直肠癌[12]、宫颈癌[13]、肺癌[14]、甲状腺癌[15]、脑胶质瘤[16]、乳腺癌[17]、食管癌[17]、胃癌[18]、卵巢癌[19]、胰腺癌[20]等恶性肿瘤的预后有密切的关系，USP22 表达增高者预后差。 USP22 可以通过上皮间质转化（EMT）促进肺癌增殖、侵袭[21]。 本实验前期研究发现，USP22 的mRNA 及蛋白水平在多个鼻咽癌细胞系（CNE-1，CNE-2）中均较正常鼻咽上皮细胞（NPEC）明显升高，为进一步肯定这一现象，本研究检测了正常鼻黏膜及鼻咽癌组织中USP22 水平，结果与细胞系一致，鼻咽癌组织USP22mRNA 及蛋白水平均上调。 更进一步的研究发现，抑制USP22 的表达使鼻咽癌细胞株生长增殖能力降低，USP22 通过使AKT/GSK-3/Cyclin 通路中的p-AKT、p-GSK-3β、cyclinD1 表达下调和GSK-3β、AKT 上调而调控细胞生长增殖周期[2]。 因此，研究者认为USP22 对鼻咽癌发生发展可能有重要影响， 下调USP22 基因水平能对肿瘤起治疗作用。

RNAi 作为一种简单有效的基因敲除方法， 能够高效、特异沉默目的基因，使突变基因稳定沉默而不影响正常基因的表达，已成为基因功能研究的有力工具。 慢病毒载体介导的RNAi 作用持续且稳定，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。 既往研究已成功构建并鉴定USP22 sh-RNA 慢病毒载体，包装成适合感染目的细胞的慢病毒颗粒，为进一步研究USP22 基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制打下坚实的基础[3]。

本研究选用BALB/c 裸鼠作为体内实验的动物模型，具有易成瘤、易饲养、相对稳定等优点。 通过观察并记录各组裸鼠种植瘤的生长情况， 研究者发现在USP22 基因表达沉默后，裸鼠成瘤时间晚，瘤体生长明显减缓。 提示沉默USP22 基因表达可使人鼻咽癌细胞株CNE-2 裸鼠移植瘤生长受到抑制。 RT-PCR和免疫组化的结果从mRNA 水平和蛋白水平显示pLL-shRNA-USP22 能明显抑制肿瘤组织中USP22的表达， 进一步说明USP22 在鼻咽癌的发展中可能起着重要的促进作用。

综上所述，本研究以pLL3.7 慢病毒质粒为载体，成功构建了重组表达质粒pLL-shRNA-USP22， 通过慢病毒介导的sh-RNA 沉默人鼻咽癌CNE-2 细胞中USP22 基因表达， 可以在裸鼠体内抑制肿瘤的生长。虽然对人体而言， 鼻咽癌瘤块内直接注射pLLshRNA-USP22 的方法并不可行， 但本研究为临床利用小RNA 干扰技术治疗鼻咽癌提供了新的治疗思路，USP22 基因有望成为鼻咽癌治疗的新靶点。

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