齐墩果酸抗矽肺大鼠TNF-α和胶原表达的实验研究*

彭海兵，王建行，刘　燕，张　娜，田景瑞，肖永红(华北理工大学冀唐学院，基础医学院，公共卫生学院，河北唐山　06000)



齐墩果酸抗矽肺大鼠TNF-α和胶原表达的实验研究*

彭海兵1△，王建行1，刘燕2，张娜2，田景瑞2，肖永红3
(华北理工大学1冀唐学院，2基础医学院，3公共卫生学院，河北唐山063000)

［摘要］目的:观察齐墩果酸对矽肺大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)和胶原表达的影响及其可能作用机制。方法: 80只SPF级Wistar雄性大鼠，随机分为对照组、模型组、齐墩果酸组和溶剂组，每组20只。除对照组外，其余组大鼠采用非暴露法气管内一次性注入SiO2悬液(250 mg/kg)复制动物矽肺模型。齐墩果酸组自注射SiO2后每天给予齐墩果酸60 mg/kg灌胃，溶剂组每天用0.6%羧甲基纤维素钠溶液(10 mL/kg)灌胃，对照组用生理盐水(10 mL/kg)灌胃，连续56 d。动物分别在注射SiO2后第7、14、28和56天处死(每次每组5只)。处死后检测各组大鼠肺系数，并观察形态学变化;应用ELISA法检测大鼠血清中TNF-α的含量;试剂盒检测肺组织中总胶原蛋白含量;免疫组织化学法检测肺组织核因子κB(NF-κB)表达。结果: (1)与对照组比较，模型组和溶剂组大鼠肺系数和总胶原蛋白含量明显升高，结合形态学变化，矽肺模型造模成功。齐墩果酸组各时点肺系数和总胶原蛋白含量比模型组和溶剂组相应时点低，但比对照组高。(2)模型组和溶剂组大鼠血清中的TNF-α含量各时点明显升高，高峰在第14天，之后稍降，但明显高于对照组，差异有统计学意义;模型组与溶剂组各时点比较，差异无统计学意义。齐墩果酸组TNF-α含量与模型组相比均降低，各时点比较差异有统计学意义。(3)模型组和溶剂组大鼠肺组织中NF-κB表达量逐渐升高，至第28天达高峰，各时点与对照组比较差异均有统计学意义。齐墩果酸组的NF-κB阳性表达趋势与模型组相同，但明显低于模型组而高于对照组，各时点与对照组比较差异有统计学意义。结论:齐墩果酸通过抑制TNF-α和胶原表达减缓矽肺纤维化的发生，可能与NF-κB通路有关。

［关键词］齐墩果酸;矽肺;肿瘤坏死因子α;胶原;核因子κB

［修回日期］2015-03-12

Effect of oleanolic acid on expression of TNF-α and collagen in silicotic rats in vivo

PENG Hai-bing1，WANG Jian-xing1，LIU Yan2，ZHANG Na2，TIAN Jing-rui2，XIAO Yong-hong3
(1Jitang College，2College of Basic Medical Sciences，3School of Public Health，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China.E-mail: leizi19760728@ sina.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe the effect of oleanolic acid (OA) on the expression of Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and collagen in silicotic rats in vivo and its possible mechanism.METHODS: Male Wistar rats were divided into 4 groups according to the randomized block design: control group，model group，OA group and solvent control group (20 rats in each group).Except control group，the rats in other groups were induced by intratracheal instillation of silicon dioxide (SiO2; 250 mg/kg).The rats in OA group were intragastrically administered with OA (60 mg/kg) from the second day of giving SiO2.The rats in solvent control group were gavaged daily with 0.6% sodium carboxymethyl cellulose solution (10 mL/kg).The rats in control group were given normal saline under the same condition for 56 consecutive days.All rats were killed at the 7th，14th，28th and 56th days.The lung coefficient was detected and the morphological changes were observed.The serum contents of TNF-α were detected by ELISA.The content of total collagen in the lung tissue was measured.The protein level of nuclear factor-κB (NF-κB) in the lung tissue was determined by immunohistochemical method.RESULTS: (1) According to the morphological changes，the silicosis model was successfully established.Compared with control group，the lung coefficient and total collagen increased obviously in model group and solvent control group.The lung coefficient and total collagen content in OA group at each time point reduced compared with those in model group and sol-vent group，and increased compared with those in control group at the corresponding time points.(2) The serum contents of TNF-α in model group and solvent control group significantly increased，peaking at the 14th day，slightly decreasing afterward，and showing statistically significant difference at each time point compared with those in control group.No significant difference between model group and solvent group at different time points was observed.OA had inhibitory effect on the contents of TNF-α compared with model group and solvent group at the corresponding time points.(3) NF-κB in model group and solvent control group significantly increased，peaking at the 28th day，and showing statistically significant difference at each time point compared with those in control group.The NF-κB expression in OA group was similar to model group，but significantly decreased compared with control group at each time point.CONCLUSION: OA inhibits the expression of TNF-α and collagen and attenuates the silicosis fibrosis，which may be related to the NF-κB pathway.

［KEY WORDS］Oleanolic acid; Silicosis; Tumor necrosis factor-α; Collagen; Nuclear factor-κB

齐墩果酸(oleanolic acid，OA)是一种齐墩果烷型五环三萜类化合物，广泛存在于食物、医学草本植物和其它植物中，以皂苷或游离形式出现，具有保肝解毒、调节糖脂、抗炎、抗病毒、抗氧化、调节免疫、抗突变、抗癌多种生物活性［1］，是一种具有开发潜力的植物先导化合物。矽肺病是全球分布范围最广、患病人数最多、不能治愈但完全可以预防和控制的职业病。有研究显示［2］，OA具有抑制小鼠肝纤维化的作用，但在防治矽肺方面的研究国内外未见相关文献报道。本研究应用二氧化硅(SiO2)诱导大鼠建立矽肺模型，观察OA对矽肺纤维化过程中早期炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)以及胶原表达的影响，探讨OA拮抗矽肺的作用及其机制，为矽肺患者的临床预防及治疗提供一定的理论依据。

材料和方法

1实验材料

健康SPF级雄性Wistar大鼠80只，体重190～210 g，合格证号为SCXK-(军) 2009-003，经本单位实验动物伦理委员会批准，于华北理工大学实验动物中心［设施许可证编号SYXK(冀) 2010-0038］饲养，自由进食饮水，温度(22±2)℃，湿度70%～80%，昼夜交替。OA购自中国药品生物制品检定所，批号110742-200513，纯度99.9%，临用时将其溶于0.6%羧甲基纤维素钠配成混悬液; SiO2粉尘购自中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所(95%以上颗粒直径＜5 μm，游离SiO2＞97%)，180℃恒温下烘烤6 h，用灭菌生理盐水配成浓度为50 g/L粉尘悬液，高压灭菌，4℃储存备用; ELISA试剂盒和Masson染液试剂盒购自南京建成生物工程研究所;羟脯氨酸试剂盒购自北京中山生物技术有限公司;兔抗大鼠NF-κB抗体及羊抗兔IgG购自Santa Cruz。

2实验方法

2.1分组造模与标本制备大鼠称重，编号，随机分为4组，即对照(control)组、模型(model，M)组、OA组和溶剂(solvent，S)组，每组20只。适应性饲养1周后，除对照组外，其余组大鼠采用非暴露法气管内一次性注入SiO2悬液(250 mg/kg)复制动物矽肺模型。OA组自注射SiO2后每天灌胃齐墩果酸60 mg/kg，溶剂组每天灌胃0.6%羧甲基纤维素钠溶液(10 mL/kg)，对照组灌胃生理盐水(10 mL/kg)，连续56天。以上动物分别在注射SiO2后第7、14、28、56天处死(每次每组5只)。各组大鼠在处死前禁食12 h，称量体重，腹主动脉取血，常规制备血清;肉眼观察双肺，称量肺脏重量，计算肺系数，肺系数=肺湿重(mg)/体重(g) ;取右肺下叶组织做HE染色和Masson染色，左肺组织用于羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)测定，右肺上叶组织用于免疫组化检测。

2.2 ELISA法检测大鼠血清中TNF-α的含量严格按照试剂盒说明书提供的方法进行反应，将抗大鼠TNF-α的单抗包被于酶标板上，加入标准品与之结合，再加入生物素化监测抗体，形成“抗体-TNF-α-抗体”复合物，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素与亲和素特异性结合。加入显色剂后，用酶标仪测450 nm吸光度(A)值，TNF-α浓度与A450值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中TNF-α浓度。

2.3 HYP试剂盒检测肺组织中总胶原蛋白含量实验步骤严格按照试剂盒进行。HYP(mg/g)=(测定管吸光度值－空白管吸光度值)/(标准管吸光度值－空白管吸光度值)×标准管浓度×(水解液总体积/组织湿重)。总胶原蛋白的含量(mg/g)以胶原蛋白中羟脯氨酸的质量百分浓度为13%进行计算。

2.4免疫组化法检测肺组织NF-κB的表达水平应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)检测肺组织NF-κB表达，方法步骤严格按试剂盒说明书进行(NF-κB I抗以PBS缓冲液稀释为1∶100作为工作液)，用PBS缓冲液代替I抗作阴性对照。具体操作如下: 4 μm厚切片，常规脱蜡水化; 3% H2O2，去除内源性过氧化物酶;正常血清封闭，加I抗4℃过夜;次日滴加生物素标记II抗和链霉亲和素过氧化物酶，DAB显色;苏木精复染，透明，封固。将染色后的组化切片用扫描仪进行扫描，经北京航空航天大学自动图像分析系统进行图像采集和半定量分析，每张玻片随机选取6个视野，取其平均吸光度值为量化指标。

3统计学处理

所有结果均以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0软件进行完全随机设计的单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1各组大鼠肺脏形态学观察结果

对照组大鼠双肺呈淡粉色，表面光滑，各个时点无明显异常改变。模型组和溶剂组大鼠第7天时可见肺表面充血、体积稍大，重量增加;第14天时有散在的点状、灶状出血，肺脏增大、增重，质稍硬，肺表面及切面可见大量粟粒大小的灰白色结节;第28天时双肺苍白，体积缩小，硬度增加，表面结节样改变; 第56天时结节凸出于肺表面，并有融合病灶，质地较硬。OA组大鼠第14天时肺呈淡粉色，偶见点状出血，可见散在粟粒大小结节病灶;第28天时仍可见双肺散在分布粟粒大小的灰白色结节，质稍硬，未凸出肺表面;第56天时局部散在小结节，无硬化和实变。右肺下叶组织HE染色，光学显微镜下观察符合实验性矽肺King五级分类法:模型组和溶剂组大鼠第7天时大量炎性细胞浸润，肺泡腔和肺间质可见炎性细胞灶;第14天时仍有大量炎性细胞，肺泡间隔增宽增厚，少量散在的细胞性结节;第28天时弥漫性胶原纤维增多，可见较多细胞性结节和少量的纤维性结节，以I+级结节为主，第56天时纤维性结节互相融合，以III级结节为主，表明造模成功;齐墩果酸组大鼠第28天和第56天均以I级细胞性结节为主。Masson染色结果显示:胶原纤维呈蓝色，肌纤维、胞质、红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色。对照组大鼠支气管周围及肺泡间隔区有少量蓝色的胶原纤维分布。模型组和溶剂组大鼠第28天时胶原纤维明显增加，肺泡间隔增厚，结节内胶原纤维不规则排列;第56天时可见胶原沉积更加致密，且结节内数量不等的胶原纤维呈同心圆排列，纤维化程度加重。OA组大鼠肺组织胶原沉积明显减少，呈小片状或小束状，改善情况显著，见图1。

Figure 1.The morphological observation of lung tissus with HE staining and Masson staining.Scale bar=100 μm.图1各组大鼠肺组织的HE染色和Masson染色观察

2各组大鼠肺系数变化结果

由表1可见，各时点模型组大鼠肺系数与溶剂组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05) ; OA组肺系数比模型组和溶剂组低，比对照组高(P＜0.05)。

表1　矽肺大鼠肺系数的变化Table 1.Coefficient of lung in silicosis rats (mg/g.Mean±SD.n=5)

3 ELISA法检测大鼠血清中TNF-α的变化情况

对照组大鼠血清中的TNF-α含量在各时点表达无明显差异(P＞0.05)。模型组和溶剂组大鼠血清中的TNF-α含量在各时点明显升高，高峰在第14天，之后稍降，但明显高于对照组，差异显著(P＜ 0.05)，但模型组和溶剂组2组间各时点比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。OA组的TNF-α含量比模型组均低(P＜0.05)。模型组和OA组大鼠血清中TNF-α在第14天明显高于第28、56天，见表2。

表2　矽肺大鼠血清中TNF-α含量的变化Table 2.The serum content of TNF-α in the rats with silicosis (ng/L.Mean±SD.n=5)

4肺组织中总胶原蛋白含量

模型组和溶剂组肺组织中总胶原蛋白含量比同

期对照组明显增加(P＜0.05)，但模型组和溶剂组同时点比较差异无统计学意义(P＞0.05)。OA组与模型组和溶剂组相比，总胶原含量明显下降(P＜0.05)，见表3。

表3　矽肺大鼠肺组织中总胶原蛋白含量的变化Table 3.The content of collagen in the lung of rats with silicosis (mg/g.Mean±SD.n=5)

5免疫组织化学法检测肺组织NF-κB表达

对照组大鼠肺组织中NF-κB表达量各时点无明显差异(P＞0.05)。模型组和溶剂组大鼠肺组织中NF-κB的表达量逐渐升高，于第28天达高峰，各时点与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。OA组的NF-κB阳性表达趋势与模型组相同，但明显低于模型组而高于对照组(P＜0.05)，见图2、表4。

讨论

矽肺是由长期吸入职业性粉尘(SiO2)引起的，肺部炎症导致肺泡持续性损伤及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的反复破坏、修复、重建和过度沉积，引起正常肺组织结构破坏，病理表现为早期的肺泡炎和后期的肺纤维化。其中，SiO2启动肺泡巨噬细胞膜表面的脂质过氧化自由基反应，使巨噬细胞受损，释放许多活性因子引起肺部纤维化是矽肺的最直接原因［3］。

TNF-α是一重要的前炎症介质，主要由激活的肺泡巨噬细胞产生和分泌，具有广泛生物活性，与肺纤维化和间质性炎症有关。在大鼠矽肺实验早期，TNF-α在血清中含量明显增加［4］，TNF-α mRNA表达也明显增高［5］。本实验研究发现，TNF-α在矽肺模型第14天达高峰，之后稍降，但仍高于对照组，维持在较高水平，与文献报道一致。TNF-α在肺纤维化早期阶段具有重要作用。它可增加中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的功能，并刺激其产生超氧化物，释放溶酶体酶，对其周围组织细胞产生毒性作用，它还可介导其它细胞因子和炎症因子的表达，加重炎症反应，促进成纤维细胞的增殖并分泌大量的胶原。NF-κB是一种多功能的核转录因子，具有广泛的生物活性。在肺纤维化中，NF-κB通过调控多种细胞因子、黏附分子、趋化因子、炎症介质、蛋白质酶等基因的转录，介导了肺泡炎和肺纤维化。王世鑫等［6］的实验说明，TNF-α和NF-κB共同参与了SiO2粉尘致肺纤维化的病理过程。

Figure 2.The protein expression of NF-κB in the lung tissues with immunohistochemical staining.Scale bar=100 μm.图2各组大鼠肺组织NF-κB蛋白表达

表4　 SP法检测肺组织NF-κB表达结果Table 4.The protein expression of NF-κB in the lung of the rats with silicosis (Mean±SD.n=5)

OA在自然界分布十分广泛，据不完全统计，以游离形式或与糖结合形式存在于约60个科190种植物中，如人参、甘草、丁香、女贞子、三七等，尤其我国是提取OA的重要原料国家［7］。OA具有消炎、增强免疫、抑制血小板降集、降糖等多方面的临床药理作用，还具有护肝、抗高血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等生物活性，是治疗急性黄胆型肝炎和慢性病毒性肝炎比较理想的药物，且毒性低副作用少［8］。目前国内有齐墩果酸片、藏茵陈胶囊等产品应用于临床［9］。但OA在肺纤维方面的研究尚未见相关文献报道。本实验发现，OA可以明显抑制血清TNF-α含量和肺组织NF-κB表达。已有实验报道［10］鹿角草中分离得到的OA，通过抑制NF-κB的激活，下调脂多糖诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎性细胞因子表达，抑制一氧化氮和前列腺素等炎症介质生成。Martín等［11］报道OA通过对Thl/Th2的调控，抑制炎性细胞因子和化学因子表达，提高抗炎细胞因子表达。OA似乎是阻断NF-κB信号转导通路，下调炎性细胞因子和诱生型炎症介质合成酶表达，抑制炎症介质生成。在单核细胞，齐墩果酸类似物可以作为抑制剂，抑制TNF-α、IL-1β产生［12］。

ECM在肺组织内过多沉积是肺纤维化的主要特征。胶原蛋白是ECM主要蛋白，构成了肺组织的主要骨架;羟脯氨酸是胶原分解代谢的产物，机体内的羟脯氨酸主要存在胶原中，因此，羟脯氨酸测定是反映胶原含量的重要指标。本实验通过羟脯氨酸测定、肺组织形态学观察、肺脏器系数变化说明大鼠矽肺模型造模成功，而OA可以明显减轻这些变化，提示OA具有减缓矽肺纤维化的作用，但具体作用机制尚需进一步研究证实。

［参考文献］

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通讯作者△Tel: 0315-8114064; E-mail: leizi19760728@ sina.com

*［基金项目］河北省中医药管理局课题(No.2014059) ;河北省卫生计生委课题(No.ZD20140450)

［收稿日期］2014-11-26

［文章编号］1000-4718(2015)06-1081-06

［中图分类号］R135.2; R363.2

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.020