mTORC2通路在苯丙胺致大鼠纹状体损伤中的变化*

王海树，何文姬，宿宝贵，潘三强(暨南大学医学院人体解剖学系，广东广州　510632)



mTORC2通路在苯丙胺致大鼠纹状体损伤中的变化*

王海树，何文姬，宿宝贵，潘三强△
(暨南大学医学院人体解剖学系，广东广州510632)

［摘要］目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)通路在苯丙胺致中枢神经损伤过程中的变化。方法:通过注射苯丙胺建立大鼠动物模型，采用open field方法测试大鼠的自主行为活动，用透射电镜观察大鼠纹状体的超微结构，用Western blot方法检测mTORC2信号通路的变化，用免疫组化方法观察mTORC2阳性神经元的变化。结果:苯丙胺大鼠在行为学上出现刻板行为，纹状体细胞和神经纤维的超微结构受损，磷酸化的mTORC2和蛋白激酶B(Akt)表达减少，并且磷酸化的mTORC2阳性细胞也减少。结论: mTORC2通路的抑制可能在苯丙胺致纹状体结构的损伤中起重要作用。

［关键词］苯丙胺;纹状体;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2;蛋白激酶B

［修回日期］2015-03-10

Change of mTORC2 pathway in amphetamine-induced injury in rat striatum

WANG Hai-shu，HE Wen-ji，SU Bao-gui，PAN San-qiang
(Department of Anatomy，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tpsq@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To explore the change of mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2) pathway in amphetamine (AMPH) -induced injury in the central nervous system in rats.METHODS: The animal model was established by intraperitoneal injection of AMPH (2.5 mg ·kg－1·d－1).SD rats were randomly divided into control，saline and AMPH groups.The rat autonomous behaviors were tested by open field experiment.The changes of the neurons and fibers in the rat striatum were observed under transmission electron microscope.The change of mTORC2 signaling pathway in the striatum was detected by Western blot.The immunohistochemical method was applied to observe the changes of mTORC2 positive neurons in the striatum.RESULTS: The stereotyped behavior in AMPH group at 7 d and 14 d was induced.The ultrastructural injury of the neurons and fibers in the striatum was observed in AMPH group at 14 d.In the striatum，p-Rictor (S1219) expression in AMPH group was reduced compared with control group (P＜0.01)，and the protein level of p-Akt (T308) in AMPH group at 14 d was decreased (P＜0.01).The number of p-Rictor (S1219) positive cells in AMPH group at 7 d and 14 d was reduced compared with control group.The result was consistent with that of Western blot.CONCLUSION: The structural damage of the striatum induced by AMPH may be associated with the inhibition of mTORC2/Akt signaling pathway.

［KEY WORDS］Amphetamine; Striatum; Mammalian target of rapamycin complex 2; Protein kinase B

苯丙胺(amphetamine，AMPH)、3，4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺(摇头丸)和甲基苯丙胺(冰毒)都属于苯丙胺类兴奋剂(amphetamine-type stimulants，ATS)，为合成类毒品。2013年联合国毒品调查报告指出，ATS的吸毒者远超过鸦片、可卡因和海洛因等的吸毒人数，仅次于大麻。短期使用ATS，可使身体产生致幻性、高热，以及心、肝、肾等器官损伤，长期或过量滥用可致药物依赖性、中枢损伤和精神错乱等［1］。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族，是丝氨酸/苏氨酸激酶的一种。mTOR在细胞内有mTOR复合物1(mTOR complex 1，mTORC1)和mTORC2两种形式［2］。mTORC1对雷帕霉素敏感，近年来研究表明，精神类药品、大麻、鸦片和酒精引起的成瘾行为、神经调节与mTORC1密切相关［3-4］。mTORC2对雷帕霉素不敏感，由mTOR、Rictor、mLST8、mSin1、PRR5和Deptor组成。Rictor是mTORC2的特异性成分，在mTORC2复合物中起着发挥mTORC2蛋白激酶活性的作用［5］，从而使下游的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)磷酸化进而激活Akt的各条途径。

已知mTORC2与细胞的骨架运动有关［6］。但它与中枢神经系统损伤的关系及在成瘾药物中所起的作用目前并不清楚。故本文通过注射苯丙胺建立大鼠动物模型，探讨mTORC2信号通路与苯丙胺致大鼠纹状体损伤的关系。

材料和方法

1材料

从中山大学实验动物中心购买SPF级雄性SD大鼠60只，体重160～180 g，将大鼠分为空白组、生理盐水组，苯丙胺1 h、1 d、7 d和14 d组，每组10只。苯丙胺1 h组只给予苯丙胺注射1次，在给药后1 h取材;苯丙胺1 d组、7 d组和14 d组分别每天给药1次，并于末次给药后24 h内取材;而空白组、生理盐水组与苯丙胺14 d组一同取材。

在大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛，麻醉后，用4℃生理盐水80 mL和4%多聚甲醛40 mL灌注心脏，取脑后放入4%多聚甲醛中进行后固定，作为免疫组化实验材料。而用生理盐水灌注后，用2%戊二醛和4%多聚甲醛40 mL进行灌注，取脑后固定，作为透射电镜实验材料。Western blot实验材料则在灌注生理盐水后，立即取纹状体，迅速放入－80oC保存。

2方法

2.1动物模型制作和行为学实验苯丙胺用生理盐水按1 g/L配置，给药剂量为2.5 mg ·kg－1·d－1苯丙胺，生理盐水组注射同等剂量的生理盐水，正常对照组未给予任何处理。药后进行刻板行为评分，参照Sams-Dodd方法［7］进行。以刻板行为评分≥2分以及刻板行为持续时间≥15 min为合格模型。此外，建模过程中每组选5只大鼠进行open field测试。选择大鼠的运动轨迹、总路程、运动时间以及平均速度等指标进行比较。

2.2透射电镜观察将纹状体部位修块，行半薄切片，用甲苯胺蓝染色定位，再修块，行超薄切片，饱和醋酸双氧铀染色，饱和硝酸铅染色，在透射电子显微镜下观察，拍照。

2.3 Western blot实验组织超声裂解，用Bradford法测蛋白含量，取30 μg蛋白上样，恒压电泳，转膜，孵育I抗(p-Rictor，1∶1 000，Millipore; p-Akt，1∶1 000，Cell Signaling; tubulin，1∶1 000，Bioworld)，孵育II抗(goat anti-rabbit IgG，1∶5 000，Bioworld)，ECL显影，用凝胶成像系统进行曝光。

2.4免疫组织化学染色将脑行冰冻冠状切片，片厚25 μm。用S-P试剂盒(福州迈新公司)进行反应，即:加A液孵育，0.01 mol/L PBS漂洗后，加B液孵育，加I抗(p-Rictor，1∶200) 4℃过夜，0.01 mol/L PBS漂洗后，加C液孵育30 min，0.01 mol/L PBS漂洗后，加D液孵育，最后DAB显色。乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。随机选择不重叠的10个视野，用徕卡显微图像系统的Q-Win软件计数阳性细胞数及计算面积，每个动物取5张组织切片。

3统计学处理

实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0软件包对所得的数据进行统计学处理。对于计量资料做完全随机分组的单因素方差分析，选择Tukey法进行多重比较;而对于等级资料则采用Kruskal-Wallis检验进行比较，多重比较则采用Nemenyi法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1动物的行为学变化

1.1自主活动测试空白组与生理盐水组比较，大鼠自主活动总距离(distance)与运动速度(velocity)的差别不显著，但运动时间(time)与空白组相比增加，差异有统计学意义，说明生理盐水注射对大鼠的活动时间还是有一定的影响，但是这种影响与苯丙胺相比较小;苯丙胺1 d、7 d和14 d组大鼠自主活动的总距离、速度和运动时间比空白组都显著增加，见图1。

Figure 1.The changes of the autonomic activities in rats induced by AMPH.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs control.图1给药后各组大鼠自主活动度的比较

1.2刻板行为评分空白组和生理盐水组相比刻板行为评分无显著差异。而苯丙胺7 d组、14 d组与空白组比较，刻板行为评分增加，差异显著(P＜0.01)，见表1。

表1　各组SD大鼠刻板行为评分表Table 1.Stereotyped behavior scores of the rats induced by AMPH (n=10)

2苯丙胺对大鼠纹状体神经元与神经纤维结构超微结构的损伤

空白组大鼠纹状体的细胞结构清晰，胞核完整，髓鞘层次清楚(图2A)。苯丙胺1 d组的胞体以及髓鞘结构与正常组相似(图2B和2C) ;苯丙胺14 d组细胞核皱缩(图2D)，线粒体嵴断裂、减少(图2E) ;髓鞘变薄、变形(图2F)。

3苯丙胺对mTORC2/Akt信号通路的抑制

在纹状体部位，苯丙胺1 h组p-Rictor的表达有所下降，但与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。苯丙胺1 d组、7 d组和14 d组p-Rictor的表达则受到严重抑制，比空白组明显降低(P＜0.05)。苯丙胺1 h组、1 d组和7 d组p-Akt(T308)的表达与对照组相比没有明显变化(P＞0.05)。随着时间延长，苯丙胺14 d组p-Akt(T308)的表达与空白组比较显著下降(P＜0.01)，见图3。

4苯丙胺对p-Rictor阳性细胞的影响

在纹状体的p-Rictor(S1219)免疫阳性细胞胞核淡染，胞浆着色深。空白组和生理盐水组之间的阳性细胞数比较无显著差异。苯丙胺1 h组和7 h组p-Rictor的阳性细胞数与空白组相比有所减少，但无显著差异(P＞0.05)。苯丙胺7 d组和14 d组与空白组比较，纹状体部位的p-Rictor阳性细胞数明显减少，(P＜0.01)，见图4。

Figure 2.The ultrastructural changes of the neurons and fibers in the striatum.A: control group; B，C: AMPH group at 1 d; D～F: AMPH group at 14 d.The scale bar=2 μm.图2大鼠纹状体部位神经元和神经纤维超微结构的变化

讨论

本研究显示，注射苯丙胺后，大鼠行为活动出现异常，自主活动增加，随着用药天数的增加，第7天出现刻板行为，而且轨迹图表明自主活动逐渐被刻板行为取代(未在结果中显示)。自主行为活动增加与刻板行为的出现主要是脑内DA释放增加所致，与黑质-纹状体DA能神经通路密切相关［8］。因此，纹状体的研究对揭示苯丙胺的中枢毒性机制有重要意义。透射电镜发现苯丙胺14 d大鼠纹状体的神经元结构受到损伤，细胞核固缩，线粒体嵴断裂。说明给予苯丙胺14 d时大鼠的纹状体受到了较严重的损伤。目前认为，苯丙胺对神经元的毒性作用与脑内DA的过量释放引起的氧化反应密切相关［1］。研究表明，苯丙胺类兴奋剂可以通过DA转运体进入神经末梢，从而取代神经末梢囊泡内的DA，导致DA大量释放，通过单胺氧化酶和自身的氧化作用，产生超氧化物阴离子和过氧化氢，最终导致神经元的死亡［9］。此外，由于苯丙胺类兴奋剂具有亲脂性，因此，可以进入线粒体，促使线粒体依赖的凋亡［10］，线粒体功能异常可导致能量代谢障碍、钙离子稳态失调以及产生活性氧等神经元损伤过程。

Figure 3.The results of Western blot showed the protein levels of p-Rictor (S1219) and p-Akt (T308) in the striatum.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs saline.图3 Western blot示纹状体p-Rictor及p-Akt蛋白的表达

本研究发现注射苯丙胺1 d后，纹状体部位mTORC2磷酸化的表达显著减少，注射至14 d，mTORC2磷酸化的表达也一直处于减少状态，这说明短期和长期使用苯丙胺都能抑制mTORC2的活性。免疫组化显示磷酸化mTORC2免疫阳性细胞的数量在7 d后显著减少，与Western blot结果基本一致。表明mTORC2受到抑制之后，纹状体的神经细胞才出现损伤，同时提示mTORC2的抑制可能与神经细胞的损伤密切相关。目前，国内外还未见类似报道。由于mTORC2的上游分子不清楚，至今对mTORC2的功能及其信号通路都了解的非常少，因而，对该结果的原因及其机制还不清楚。现已知mTORC2可能通过蛋白激酶C调节肌动蛋白的聚合而影响神经细胞的形态［11］，敲除mTORC2的Rictor基因会导致雄性小鼠寿命缩短30%至40%［12］。另外，mTORC2可以直接磷酸化Akt［13］。由于Akt的功能与细胞的增殖和存活有关，它功能的失调会导致癌症、糖尿病、心血管疾病和神经系统的疾病［14］，而且Akt的抑制与神经元的损伤有密切关系［15］，故本文检测了mTORC2下游分子Akt磷酸化的变化。结果表明，注射苯丙胺1 h、1 d和7 d，纹状体部位Akt (Thr308)磷酸化的表达没有明显变化，注射苯丙胺至14 d，Akt(Thr308)磷酸化的表达则显著减少。Akt的抑制没有与mTORC2同时发生，而是在mTORC2抑制之后，提示Akt(Thr308)的磷酸化可能对mTORC2的抑制不敏感，呈延后现象。有1篇与本文用药剂量接近的文献报道［17］，给小鼠注射2 mg/kg苯丙胺，至第8天才观察到纹状体Akt磷酸化的表达下降，也说明了苯丙胺可以抑制Akt的活性，但需要较长的时间。此外，Akt的上游分子除了mTORC2外，还有PI3K、CTMP、PHLPP和PP2A 4个分子，推测其中一些分子也可能受到了苯丙胺的影响，导致Akt变化的复杂性，所以Akt的变化没有与mTORC2同时发生。

Figure 4.Immunohistochemical staining showed the p-Rictor positive neurons in the straitum.The box in the first image represents the region of magnification in the striatum.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs saline.图4纹状体p-Rictor免疫阳性细胞的表达

苯丙胺除了造成纹状体神经元胞体的损伤，对神经纤维毒性更明显，电镜结果表明纹状体的髓鞘变薄，结构扭曲变形。这可能是长期使用苯丙胺导致精神障碍的一个重要基础。众多研究表明精神分裂症患者脑的髓鞘结构松散或变薄［18-19］。目前认为精神分裂症患者的主要原因在于神经元之间的联系出现病变以及神经纤维的髓鞘发生了损伤，因为髓鞘损伤会导致神经纤维传导失常，从而破坏了神经元活动的同步性，以致神经元活动异常［20］。

综上所述，苯丙胺进入中枢神经系统后，导致了纹状体神经元胞体及其神经纤维的损伤，该损伤与苯丙胺抑制mTORC2/Akt信号通路可能密切相关。这提供了一个苯丙胺损伤中枢神经的新机理，同时也说明了苯丙胺可以作为mTORC2的上游分子，其具体作用机理尚不清楚，需要深入研究，以进一步阐明揭示苯丙胺的中枢毒性机制。

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通讯作者△Tel: 020-85220251; E-mail: tpsq@ jnu.edu.cn

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81470055)

［收稿日期］2014-12-11

［文章编号］1000-4718(2015)06-1042-06

［中图分类号］R749

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.014