WNT5B在乳腺癌中的表达及意义

刘洪涛，周凡涵，申媛媛，张艾洁，赖艳梅，厉红元(重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科，重庆400016)



WNT5B在乳腺癌中的表达及意义

刘洪涛，周凡涵，申媛媛，张艾洁，赖艳梅，厉红元△
(重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科，重庆400016)

［摘要］目的:研究WNT5B在乳腺癌中的表达，初步探讨WNT5B与乳腺癌临床病理特征的关系。方法:采用real-time PCR和Western blot法检测67例乳腺癌及癌旁组织中WNT5B在mRNA和蛋白水平的表达情况，通过免疫组织化学方法检测WNT5B在乳腺癌和癌旁组织中的表达并分析WNT5B的表达与相关临床病理指标之间的关系。结果: 67例乳腺癌组织标本中均有不同程度WNT5B的mRNA及蛋白表达，且WNT5B在乳腺癌组织的表达明显低于癌旁组织(P＜0.05) ;其中WNT5B在原发性肿瘤大小T≤20 mm的乳腺癌患者中的表达明显高于其在T＞20 mm组患者中的表达(P＜0.05) ; WNT5B的表达与乳腺癌患者腋窝淋巴结转移情况、组织学分级、相关的免疫组织化学指标(ER、PR、c-ErBb-2、p53和Ki-67)之间无明显的相关性(P＞0.05)。结论: WNT5B在乳腺癌组织中的表达低于癌旁组织，WNT5B表达与乳腺癌患者原发肿瘤大小呈负相关，提示WNT5B可能作为乳腺癌预后的一个新的分子标志物，为乳腺癌的诊治提供新的思路。

［关键词］WNT5B表达;乳腺癌

［修回日期］2015-04-15

Expression of WNT5B in breast cancer and its clinical significance

LIU Hong-tao，ZHOU Fan-han，SHEN Yuan-yuan，ZHANG Ai-jie，LAI Yan-mei，LI Hong-yuan
(Department of Endocrinology and Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail: hongy_li@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the expression of WNT5B in the breast cancer and further to discuss the correlation between WNT5B and clinicopathologic characteristics of breast cancer.METHODS: The expression of WNT5B at mRNA and protein levels was measured by real-time PCR and Western blot in 67 cases of breast cancer and the tissue adjacent to carcinoma.In addition，the immunohistochemical method was used to detect the expression of WNT5B in the breast cancer and the tissue adjacent to carcinoma.The relationships between WNT5B expression and clinicopathologic indexes were also analyzed.RESULTS: The expression of WNT5B in the breast cancer was obviously lower than that in the tissue adjacent to carcinoma (P＜0.05).The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in 67 samples of breast cancer was in various degrees.The expression of WNT5B in T≤20 mm group of human breast cancer was obviously higher than that in T＞20 mm group (P＜0.05).The expression of WNT5B had no obvious correlation with axillary lymph node metastasis，histological grade and immunohistochemical indexes of ER，PR，c-ErBb-2，p53 and Ki67 (P＞0.05) in the breast cancer.CONCLUSION: The expression of WNT5B decreases obviously in breast cancer.The expression of WNT5B is related to primary tumor size，which provides new ideas for the diagnosis and treatment of breast cancer，suggesting that WNT5B may be a new molecular marker for prognosis of breast cancer.

［KEY WORDS］WNT5B expression; Breast cancer

乳腺癌是严重影响女性身心健康的恶性肿瘤之一，近年我国乳腺癌发病率逐年增长，位居女性恶性肿瘤首位［1-2］。目前信号通路途径治疗恶性肿瘤是生物治疗的新兴领域，Wnt信号家族与乳腺癌密切相关，高达60%的乳腺癌患者Wnt蛋白过度表达［3-4］，在促进肿瘤的发生、发展发挥关键作用［5-6］。WNT信号通路功能广泛、机制复杂，WNT5B作为WNT通路众多配体之一，以旁分泌或自分泌的方式参与非经典WNT通路，参与胚胎发育时期细胞命运和组织分化类型的调控以及肿瘤的发生［7-8］。研究显示，WNT5B在恶性骨肉瘤、肝癌及结肠癌中高表达，且与肿瘤的恶性程度及转移能力密切相关［8-11］，提示WNT5B可能是潜在的肿瘤相关基因。本研究拟通过检测乳腺癌和乳腺癌旁组织中WNT5B表达情况并观察分析其与临床病理指标的关系，旨在初步探讨WNT5B与乳腺癌发生、发展的作用，为寻找乳腺癌新的靶点和判断预后提供理论依据。

材料和方法

1标本来源

收集2013年10月～2014年5月在重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科手术切除乳腺癌组织及距离癌灶5 cm以上癌旁组织标本各67例，年龄30～80岁，平均年龄49岁。经术后病理诊断证实为乳腺癌，所有患者均为女性且未行术前放、化疗及免疫治疗。所有标本在离体后30 min内立即放入经DEPC水处理后的冻存管置于液氮保存，部分标本以4%多聚甲醛保存。

2主要试剂和仪器

TRIzol总RNA提取试剂(Invitrogen) ;逆转录试剂盒、real-time PCR试剂盒和DNA Marker (TaKaKa) ; SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂和II抗(北京中杉公司) ;鼠抗人WNT5B单克隆抗体(Santa Cruz) ; real-time PCR仪(ABI) ;自动酶标仪(Thermo) ;凝胶成像系统(Bio-Rad)。

3方法

3.1免疫组化(SP法)检测WNT5B蛋白的表达

标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规制备免疫组织化学石蜡切片，免疫组化用SP法检测。置67℃恒温烤箱烘烤2 h后，石蜡切片经脱蜡，抗原修复血清封闭，加鼠抗人WNT5B抗体(滴度1∶100)置4℃孵育过夜，37℃复温后反复PBS清洗;加生物素标记(滴度1∶1 000免疫组化试剂)，37℃孵育15 min;加辣根过氧化物酶标链霉菌抗生物素蛋白工作液;显微镜下控制DAB显色，清洗后，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶液封片，镜下观察结果。光镜下细胞质内出现棕色颗粒表示WNT5B免疫反应呈阳性，无棕色颗粒出现为阴性。每张切片由2名病理医师在双盲法下进行判定。

3.2 Real-time PCR检测WNT5B mRNA的表达冰冻组织按TRIzol总RNA提取试剂说明书操作。取等量RNA模板加样，使用逆转录试剂盒将按说明书操作完成逆转录后，得到cDNA第1链。以β-actin为内参照。WNT5B的上游引物为5’-AAATGCCACGGCGTCTCG-3’，下游引物为5’-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3’，扩增片段为163 bp;β-actin的上游引物为5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游引物为5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’，扩增片段为315 bp。PCR反应体系为10 μL体系: SYBR@Premix Ex TaqTM5 μL，上、下游引物各0.1 μL，无酶水3.8 μL，cDNA 1 μL。反应条件为95℃预变性3 min;95℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，39个循环;65℃延伸15 s。采用2－ΔΔCt法计算以β-actin表达量为基准的WNT5B基因相对值作为统计数据。

3.3 Western blot检测WNT5B蛋白的表达取匀浆器碾碎组织后加细胞裂解液、PMSF和Cocktail提取组织总蛋白。酶标仪检测蛋白浓度，取相同质量蛋白加入上样缓冲液100℃煮沸变性10 min，配置10%分离胶进行SDS-PAGE，4℃冷库内100 V 100 min恒压将蛋白印记电转至PVDF转印膜上，5%脱脂奶粉PBST液封闭1 h;鼠抗人WNT5B单克隆抗体(1∶1 000) 4℃冷库孵育过夜;取出PVDF转印膜室温下PBST反复清洗3次，每次约10 min;加羊抗鼠II抗(1∶1 000)室温孵育40 min; PVDF转印膜室温下PBST反复清洗3次，每次约10 min;取化学发光反应试剂盒中A液和B液等体积混合，加混合液到PVDF膜上暗室进行化学发光反应。暗室胶片曝光。使用Quantity One软件分析各个样本，分别测量各组中不同基因的灰度值，以β-actin灰度值为基准，WNT5B/β-actin的相对值作为统计数据。

4统计学处理

使用SPSS 19.0软件进行数据处理和分析检验，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两组数据间比较行t检验，3组数据间比较行单因素方差分析和SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 SP法检测WNT5B在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达

对所收集的67对乳腺癌及相对应的癌旁组织进行组织固定、包埋、切片，经免疫组化染色发现，WNT5B主要位于细胞胞质中。在癌旁组织和乳腺癌组织中WNT5B表达率分别为78.6%和21.4%。WNT5B蛋白在乳腺癌组织中的表达量低于癌旁组织(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of WNT5B detected by the method of immunohistochemistry in breast cancer and the tissue adjacent to cancer (×100).图1 WNT5B在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达

2 Real-time PCR检测WNT5B在乳腺癌组织和癌旁组织中mRNA的表达水平

WNT5B mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中均有表达，且癌组织中表达量明显低于癌旁组织(P＜0.01)，见图2。

Figure 2.The mRNA expression of WNT5B in the breast cancer and the tissue adjacent to cancer.Mean±SD.n=20.＊＊P＜0.01 vs adjacent group.图2 WNT5B mRNA在乳腺癌及其癌旁组织中的表达

3 Western blot检测WNT5B蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达

通过Western blot法检测乳腺癌组织和癌旁组织中WNT5B蛋白的表达情况，结果显示WNT5B蛋白在乳腺癌组织中表达量明显低于癌旁组织(P＜0.05)，见图3。

4 WNT5B在乳腺癌中表达与乳腺癌临床病理特征的关系

经统计学分析显示，WNT5B mRNA及蛋白在乳腺癌中的表达与腋窝淋巴结转移、不同激素受体(EP、PR)状况、c-ErBb-2、p53、Ki67表达情况和组织学分级间无显著差异(P＞0.05) ;在肿瘤大小T≤20 mm组中显著增高(P＜0.05)，见表1、2。

Figure 3.The protein levels of WNT5B in breast cancer and the tissue adjacent to cancer.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs adjacent group.图3 WNT5B蛋白在乳腺癌及其癌旁组织中的表达

表1　 WNT5B mRNA及蛋白表达与乳腺癌组织学分级之间的关系Table 1.The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in breast cancer and their relationships with the histological grade of breast cancer (Mean±SD)

讨论

WNT5B主要位于细胞胞质内，参与胚胎发育和多种疾病发生的病理过程［12-13］，Bradley等［7］研究发现在骨肉瘤细胞中WNT5B通过抑制JNK信号的中断影响软骨细胞的增殖与迁移，Kato等［14］在人肺癌A549细胞和人胰腺癌Panc-1细胞中的研究发现，WNT5B参与了上皮细胞向间质细胞的转化，进而影响肿瘤细胞的侵袭能力，促进肿瘤的恶性增长，提示WNT5B对肿瘤细胞的增殖、迁移、分化等过程起着重要作用，而WNT5B在乳腺癌的发生发展中是否具有同样重要作用尚不清楚;本研究在此基础上，针对手术切除乳腺癌组织及癌旁正常组织标本各67例，通过real-time PCR、免疫组织化学染色和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测WNT5B在乳腺癌组织及癌旁组织的表达情况，发现在WNT5B乳腺癌和癌旁组织均有表达，且癌组织中的表达明显低于癌旁组织，提示我们WNT5B在乳腺癌组织中呈低表达。

进一步与临床病理特征比对分析发现WNT5B表达与腋窝淋巴结转移、EP、PR、Her2、p53、Ki67表达情况、组织学分级之间无明显相关性，而在原发性肿瘤大小T≤20 mm的乳腺癌患者中的表达明显高于其在T＞20 mm组患者中的表达，即乳腺癌T1期组患者中WNT5B表达明显高于T2期和T3期，提示WNT5B与乳腺癌原发肿瘤大小呈负相关，而肿瘤大小与肿瘤的恶性程度和治疗效果及预后生存情况密切相关，提示乳腺癌组织中低水平表达的WNT5B可能参与了肿瘤的发生、发展，其具体机制有待我们进一步探索。

综上所述，WNT5B在乳腺癌和癌旁组织中的表达存在显著差异，与乳腺癌原发肿瘤大小呈负相关，这一发现可为乳腺癌的临床治疗方案选择及预后判定提供一定的理论依据，对乳腺癌的预防与治疗具有重要意义。

表2　 WNT5B mRNA及蛋白表达与乳腺癌患者相关临床病理指标的关系Table 2.The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in breast cancer and their relationships with clinicopathologic characteristics of breast cancer (Mean±SD)

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通讯作者△Tel: 023-89011496; E-mail: hongy_li@ hotmail.com

［收稿日期］2014-12-15

［文章编号］1000-4718(2015)06-1032-04

［中图分类号］R730.23

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.012