sFlt-1及PI3K/AKT通路与子痫前期相关性研究

姚念玲，马佳佳，李 佳，陈必良

sFlt-1及PI3K/AKT通路与子痫前期相关性研究

姚念玲，马佳佳，李 佳，陈必良

目的 探讨子痫前期的脐静脉内皮细胞中sFlt-1与PI3K/AKT通路的相关性。从细胞分子水平研究子痫前期发生发展规律，寻找有效的分子治疗靶点。方法 将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在体外进行原代培养及传代。用实时定量PCR和Western-blot法分别检测sFlt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在正常妊娠的HUVECs和子痫前期的HUVECs及在经PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用的子痫前期HUVECs中的表达情况。结果 实时定量PCR和Western-blot结果均显示sFlt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在正常妊娠的HUVECs低表达；在子痫前期HUVECs中高表达；在LY294002作用后的子痫前期HUVECs中发现，阻断PI3K/AKT通路的同时sFlt-1的表达也发生了下调，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 sFlt-1可能参与子痫前期的发病过程。PI3K/AKT信号通路可能参与子痫前期的病理过程，可能成为子痫前期有效的分子治疗靶点。

子痫前期；可溶性血管内皮生长因子受体1；PI3K/AKT通路；人脐静脉内皮细胞

子痫前期(preeclampsia，PE)是一种严重影响母婴健康的产科重症，是以高血压、蛋白尿、水肿、多器官功能障碍为特征的一组疾病，发病率约为5%，病死率约为10%[1]，是围产期孕产妇及胎婴儿死亡的重要原因。因此，明确子痫前期的发病原因、机制、病理过程，病情的发展规律，找到有效的预防、治疗方法尤为重要。对于子痫前期的治疗，目前多以对症治疗为主，如：休息、解痉、降压、促胎儿肺成熟等。发现有效的分子治疗靶点是子痫前期目前亟待解决的临床问题。国内外多项研究报道，sFlt-1与子痫前期发病相关，可作为早期预测的分子标志物[2]。但多数研究是从血清学或胎盘组织学方面研究，缺乏细胞分子水平的验证。本研究利用人脐静脉内皮细胞探讨了sFlt-1与子痫前期的相关性，及PI3K/AKT信号通路在该过程中发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 经第四军医大学伦理委员会批准和患者知情同意的前提下，选择2013年9月至2014年8月第四军医大学西京医院妇产科产检并住院分娩的子痫前期患者35例，其中初产妇21例，经产妇14例，均为自然受孕，单活胎，分娩孕周≥37周，平均孕周(38.0±0.7)周，在孕期接受过相同的医学指导及治疗。最小年龄20岁，最大年龄45岁，平均年龄(31.4±6.9)岁。同时期正常妊娠分娩妇女33例，其中初产妇17例，经产妇16例，均为自然受孕，单活胎，分娩孕周≥37周，平均孕周(38.0±0.9)周，最小年龄22岁，最大年龄41岁，平均年龄(30.3±5.7)岁。子痫前期诊断按照《妇产科学》第8版中妊娠期高血压疾病分类之标准[3]。

1.2 标本采集 于产妇剖宫产后立即无菌操作取脐带，长约20 cm，轻轻挤出脐带血管中的残存血液，避免用力过度及反复揉搓。将其放入37 ℃含有100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的PBS液无菌玻璃瓶中，2 h内进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)提取及培养。细胞提取利用胰酶消化法。在37 ℃ 5% CO2培养箱(美国Thermo Scientific 公司8000)中原代培养及传代至3～4代。

1.3 样本分组 正常妊娠的产妇分娩获得的HUVECs 为NP组；子痫前期产妇分娩获得的HUVECs为PE组；子痫前期产妇分娩获得的HUVECs，经50 μm的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用2 h为LY组。

1.4 方法 实时定量PCR(试剂盒购自日本TaKaRa公司)和Western-blot法(试剂盒购自美国Bioworld Technology公司)分别检测sFlt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在NP组、PE组及LY组中的表达情况。

1.5 统计学处理 利用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，各组指标的表达量以均数±标准差表示(x±s)，组间比较进行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实时定量PCR检测3组sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)的mRNA表达 比较3组HUVECS中sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)的mRNA相对含量，差异有统计学意义(P<0.05)。如图1～3示。

注：NP：正常妊娠的产妇分娩获得的HUVECs；PE：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs；LY：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs，经50 μm的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用2 h。与NP及LY组比较aP<0.05图1 实时定量PCR检测3组sFlt-1mRNA水平的比较

注：NP：正常妊娠的产妇分娩获得的HUVECs；PE：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs；LY：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs，经50 μm的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用2 h。与NP及LY组比较aP<0.05图2 实时定量PCR检测3组PI3Kp85αmRNA水平的比较

2.2 Western-blot法检测3组sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)的蛋白表达 从实验得到的各组细胞Western-blot的sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)条带图，如图4A、图5A和图6A示。利用Quantity One软件进行各组细胞各指标Western条带的灰度分析，得出灰度值，再比内参照GAPDH基因的条带灰度值，比较各细胞样本的相对表达量即样本基因灰度值/GAPDH基因灰度值。如图4B、图5B、图6B示。差异均有统计学意义(P<0.05)。HUVECS中sFlt-1、PI3Kp85α、AKTp85α的表达在PE组高于LY组，而LY组又高于NP组。

注：NP：正常妊娠的产妇分娩获得的HUVECs；PE：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs；LY：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs，经50 μM的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用2 h。与NP及LY组比较aP<0.05图3 实时定量PCR检测3组p-AKT(ser473)mRNA水平的比较

注：NP：正常妊娠的产妇分娩获得的HUVECs；PE：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs；LY：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs，经50 μm的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用2 h。图A为Western-blot条带图，图B为细胞样本的相对表达量图4 Western-blot法检测3组sFlt-1的表达

注：NP：正常妊娠的产妇分娩获得的HUVECs；PE：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs；LY：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs，经50 μm的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用2 h。图A为Western-blot条带图，图B为细胞样本的相对表达量图5 Western-blot法检测3组PI3Kp85α的表达

注：NP：正常妊娠的产妇分娩获得的HUVECs；PE：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs；LY：子痫前期产妇分娩获得的HUVECs，经50 μm的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用2 h。图A为Western-blot条带图，图B为细胞样本的相对表达量图6 Western-blot法检测3组p-AKT(ser473)的表达

3 讨论

子痫前期是围产期孕产妇及胎婴儿死亡的重要原因。研究表明，子痫前期发病的一重要组织病理基础可能就是缺氧造成血管内皮细胞受损[4]；子宫螺旋小动脉供血不足，胎盘着床浅，导致胎盘循环血流量降低，胎儿血氧供给不足[5]。子痫前期的发病源于早期滋养层入侵子宫内膜时的不足，子宫螺旋动脉重新构建失败。这是一个复杂的过程，与恶性肿瘤细胞的某些生物学行为极为类似。缺氧能使滋养细胞和血管内皮细胞分泌sFlt-1增加[6]。

sFlt-1称为可溶性血管内皮生长因子受体1，是一种糖蛋白，其具有酪氨酸激酶活性，归属于酪氨酸激酶家族的Ⅲ型受体。sFlt-1与Flt-1都是血管内皮生长因子受体(VEGFR)。sFlt-1是VEGF的抑制物，与Flt-1竞争结合VEGF和胎盘生长因子(PLGF)，使其生物学活性被完全阻断，引起血管生成不良，发挥抑制血管生成的作用，同时造成血管壁的完整性及通透性损伤。VEGF和sFlt-1都是缺氧敏感，受缺氧诱导因子1(HIF-1)的调控，均属于缺氧反应基因[7]。诱导母胎界面 sFlt-1 表达的重要因素就是低氧[8]。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)家族成员属于原癌基因，是一种胞内磷脂酞肌醇激酶，是细胞内重要的信号转导分子，参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。研究发现，蛋白激酶B(AKT)是PI3K下游分子，两者所组成的信号通路PI3K/AKT 信号通路与人类多种疾病的发生发展密切相关，如：高血压、糖尿病、恶性肿瘤等。PI3K经过一系列的磷酸化过程激活其下游分子AKT，AKT 又通过直接磷酸化多种转录因子，如NF-κB、哺乳类动物雷帕霉素(mTOR)等，参与和调节多种生命活动过程。研究发现该通路与人类血管性、代谢性疾病以及肿瘤的发生发展、治疗及预后密切相关[9]。该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活, 其活性异常能影响肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成，目前不少肿瘤的分子靶点治疗都涉及到了PI3K/AKT信号通路的关键分子，并已成为热点课题[10]。

脐带是母胎屏障的重要组成部分，行使着母胎间物质交换的作用，子痫前期的病理变化在脐带中都会表现。脐静脉是脐带中最粗大的血管，又具备动脉特性，是研究子痫前期血管因素理想载体。在本实验中笔者选取了HUVECs作为研究对象，利用Western-blot法检测了正常妊娠分娩(NP组)和子痫前期分娩(PE组)的HUVECs中sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)的相对表达。观察数据发现，子痫前期时3因子蛋白表达均数都升高，推测子痫前期可能刺激了sFlt-1的分泌，激活了PI3K/AKT通路。用LY294002(PI3K/AKT通路特异性抑制剂)作用子痫前期的脐静脉内皮细胞后，3个因子均下调。最后通过3样本间的方差分析进行统计学分析得到sFlt-1、PI3Kp85α和p-AKT(ser473)在3组表达有差异，组间差异有统计学意义。由此得出结论：子痫前期时sFlt-1和PI3K/AKT通路的蛋白表达上调，抑制PI3K/AKT通路可使sFlt-1的表达也同时下调。说明sFlt-1与PI3K/AKT通路间在子痫前期时存在密切联系。

LY294002是目前广泛应用的PI3K通路特异性抑制剂，通过特异性抑制PI3Kpllo亚单位的催化活性，阻碍下游底物PIP3的生成，使该通路处于失活状态[11]。许多学者已经将PI3K/AKT通路的抑制用于肿瘤治疗的研究。子痫前期的治疗是医学界公认的难题。绝大多数是对症治疗或是终止妊娠。但母胎间存在着利益冲突，为了母体的健康过早地结束妊娠可能对胎儿造成很大威胁，甚至死亡。因此，学者们一直在为寻找最安全、最有效的治疗方法而不懈努力。临床工作中大多数情况下是在对症治疗的情况下采取期待疗法。许多治疗方法已应用到了临床，如休息，镇静，解痉，降压，促胎儿肺成熟治疗，拉贝洛尔、硫酸镁、低分子肝素、小剂量阿司匹林等药物的应用[12-14]。但这些均为针对缓解症状的治疗，治标不治本。本实验发现sFlt-1可能通过PI3K/AKT信号通路诱发子痫前期的发病、病理过程，这可能成为子痫前期新的分子治疗靶点。

[1] Steegers EA, von Dadelszen P, Duvekot JJ, et al. Pre-eclampsia[J]. Lancet, 2010, 376(9471): 631-644.

[2] Langenveld J，Jansen S，Van dPJ， et al. Recurrence risk of a delivery before 34 weeks of pregnancy due to an early onset hypertensive disorder: a systematic review [J]. Am J Perinatol, 2010, 27(7): 565-571.

[3] 谢幸，苟文丽. 妇产科学[M]. 北京：人民卫生出版社，2014: 64-73.

[4] Bird IM, Boeldt DS, Krupp J, et al. Pregnancy, programming and preeclampsia: gap junctions at the nexus of pregnancy-induced adaptation of endothelial function and endothelial adaptive failure in PE[J]. Curr Vasc Pharmacol, 2013, 11(5): 712-729.

[5] Rosser ML, Katz NT. Preeclampsia: an obstetrician′s perspective[J]. Adv Chronic Kidney Dis, 2013, 20(3): 287-296.

[6] Gallos ID, Sivakumar K, Kilby MD, et al. Pre-eclampsia is associated with, and preceded by, hyper triglyceridaemia: a meta-analysis[J]. BJOG, 2013, 120(11): 1321-1332.

[7] Ahmed A, Dunk C, Ahmad S, et al . Regulation of placental vascular endothelial growth factor (VEGF) and placenta growth factor (PLGF) and soluble Flt-1 by oxygen [J] . Placenta, 2006, 21: S16-S24.

[8] George EM, Granger JP. Mechanisms and potential therapies for preeclampsia[J].Curr Hypertens Rep,2011,13:269-275.

[9] O′Brien KA，Gartner TK，Hay N，et al. ADP-stimulated activation of Akt during integrin outside-in signaling promotes platelet spreading by inhibiting glycogen synthase kinase-3β[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012,32(9):2232-2240.

[10] He K，Xu T，Xu Y, et al .Cancer cells acquire a drug resistant, highly tumorigenic, cancer stem-like phenotype through modulation of thePI3K/Akt/β-catenin/CBP pathway [J].Int J Cancer，2014, 134(1):43-54.

[11] Park JK, Jeong JW, Kang MY, et al.Inhibition of the PI3K-Akt Pathway Suppresses sFlt1 Expression in Human Placental Hypoxia Models In Vitro[J]. Placenta,2010,31：621-629.

[12] Bujold E, Roberge S, Lacasse Y，et al. Prevention of preeclampsia and intrauterine growth restriction with aspirin started in early pregnancy: a meta-analysis[J].Obstetrics and Gynecology,2010,2(116)：402-414.

[13] Roberge S, Villa P, Nicolaides K，et al.Early administration of low-dose aspirin for the prevention of preterm and term preeclampsia: a systematic review and meta-analysis[J].Fetal Diagn Ther,2012,3(31)：141-146.

[14] Roberge S, Giguère Y, Villa P, et al. Early administration of low-dose aspirin for the prevention of severe and mild preeclampsia: a systematic review and meta-analysis[J].Am J Perinatol,2012,7(29):551-556.

(本文编辑：莫琳芳)

Study on the correlation between sFlt-1 and PI3K/AKT pathway in preeclampsia

YaoNianling,MaJiajia,LiJia,ChenBiliang

(DepartmentofObstetricsandGynecology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,CPLA，Xi′an710032,China)

Objective To explore the correlation between sFlt-1 and PI3K/AKT pathway in the umbilical vein endothelial cells in preeclampsia, and also to investigate the incidence and development of preeclampsia from the molecular standpoint, so as to find out effective treatment target of the disorder.Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)were cultured in vitro and developed into the next generation. The expression levels of sFlt-1, PI3Kp85α and p-AKT (ser473) in HUVECs of normal pregnancy, preeclampsia HUVECs, as well as preeclampsia HUVECs through the access of PI3K/AKT pathway inhibitor—LY294002, were detected respectively by real time quantitative PCR and Western blot.Results Detection results indicated that there were low expressions of sFlt- 1, PI3Kp85α and p-AKT (ser473) in the HUVECs of normal pregnancy, but there were high expressions of preeclampsia HUVECs. Following the inhibition by LY294002, the level of preeclampsia HUVECs revealed that the expression level of sFlt-1 was also down-regulated, with the blocking of PI3K/AKT pathway (P<0.05). Statistical significance could be noticed, when comparisons were made between them.Conclusion There were igh expressions of sFlt-1, PI3Kp85α and p-AKT (ser473) in the patients with preeclampsia in HUVECs of in vitro primary culture, indicating that sFlt-1 might be involved in the pathogenesis of preeclampsia. With the inhibition of preeclampsia HUVECs by LY294002, the expression levels of sFlt-1, PI3Kp85α and p-AKT (ser473) were all down-regulated, indicating that PI3K/AKT signal pathway might be involved in the pathogenesis of preeclampsia. It might be the effective molecular treatment target for preeclampsia.

Preeclampsia; sFlt-1; PI3K/AKT pathway; Human umbilical vein endothelial cell

710032 西安，第四军医大学西京医院妇产科

R714.24

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2015.05.017

2015-06-30)