酒精摄入损伤成年雄性小鼠生殖系统的一氧化氮机制研究

龚建军，孙俊峰，张忠明，朱建明

酒精摄入损伤成年雄性小鼠生殖系统的一氧化氮机制研究

龚建军，孙俊峰，张忠明，朱建明

目的 探讨酒精摄入损伤成年雄性小鼠生殖系统的一氧化氮机制。方法 选用10周龄的C57BL/6J小鼠，按数字表法随机分为2组：对照组(10%蔗糖，口服)和酒精摄入组(8 g/kg体质量，口服)。持续15周后，取附睾观察精子数目及活力；取血分离血清检测其中睾酮含量；取睾丸组织检测组织中睾酮含量，检测睾丸中一氧化氮(NO)水平和过氧化亚硝基阴离子(OONO-)含量，同时检测睾丸组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)蛋白表达水平。结果 酒精摄入组与对照组相比，酒精摄入组小鼠精子数目减少[(394±60)×106/ml比(221±55)×106/ml](P<0.05)，精子活力下降[(54±13)%比(23±8)%](P<0.05)；血清中睾酮含量下降(P<0.05)，睾丸中睾酮含量下降(P<0.05)，睾丸中NO水平增加(P<0.05)，OONO-含量增加(P<0.05)，睾丸中iNOS(P<0.05)和nNOS蛋白(P<0.05)表达增加。结论 长期酒精摄入后小鼠睾丸中NO合成增加是导致成年小鼠雄性生殖系统损伤的重要机制之一。

酒精；一氧化氮；成年雄性生殖系统；小鼠

近年来，我国成年男性不育的发病率呈现上升趋势。其中酒精摄入对于成年男性生殖系统健康的损伤就是其中原因之一。临床研究发现，长期酗酒者中31%～58%的人群性欲丧失，酒精中毒者中8%出现阳痿。酒精的滥用会导致血清睾酮含量降低、睾丸和附睾重量减少，精囊重量减轻，生殖上皮萎缩[1-2]。

虽然大量的临床和动物实验研究已经观察到酒精对雄性生殖系统方面的损害，但对于其作用机制，现在并不十分明确，这对于寻找有效的预防和治疗方法形成很大的障碍。本研究就是从成年雄性小鼠睾丸组织一氧化氮合成的角度来深入了解酒精中毒损伤成年雄性生殖系统的机制。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试剂 10周龄C57BL/6J小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)，总一氧化氮含量的检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)，睾酮检测试剂盒(美国R&D生物科技公司)，CELL-VUDRM-600精子计数板(美国Millennium Sciences公司)，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体(美国Santa Cruz公司)，RIPA 裂解液等Western blot实验所需试剂(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.2 实验分组 10周龄C57BL/6J小鼠分为2组：对照组(蔗糖按照5%质量比稀释，剂量是20 ml/kg体质量)、酒精组(酒精按照20%体积比稀释，剂量是8 g/kg体质量)，经过口胃管口服，每天早晨进行，每天1次，持续15周。最后1次口服24 h后断头处死小鼠，取血、附睾和睾丸组织用于检测相关指标。

1.3 精子计数和活力的检测 取出一侧附睾，称质量；置于5 ml的Eppendorf管中，加入泰氏培养液2 ml，剪碎；在30 ℃水浴锅中振摇15 min(目的是使附睾中的精子自行移行至溶液中)；吸取1滴(大约4 μl)样品，将样品置于CELL-VUDRM-600精子计数板的载玻片点样区的最边缘，在倒置显微镜下查看计数板网格，计数网格中60个小方格中的所有活动和不活动的精子；总的精子计数必须除以12，结果就是精子的浓度：×106/ml；精子活力(%)为活动精子数/总的精子数×100%。

1.4 睾酮的检测 1 000 g离心血，分离血清备用；取出睾丸，加入3 ml的RIPA 裂解液中匀浆，经4 ℃、14 000 r/min离心15 min，取上清；应用购买的睾酮检测试剂盒分别检测血清和上清液中的睾酮含量。睾丸组织中睾酮含量等于睾酮浓度/睾丸质量。

1.5 睾丸中NO含量的检测 取出睾丸，加入3 ml的RIPA 裂解液中匀浆，经4 ℃、14 000 r/min离心15 min，取上清；用碧云天公司生产的总一氧化氮含量的检测试剂盒完成检测。通过检测出其中所含有的亚硝酸盐和硝酸盐的含量，推算出组织中总的一氧化氮的生成量。按公式(相对值=总的一氧化氮浓度/睾丸质量)计算出可用于相互比较的相对值。

1.6 过氧化亚硝基阴离子(OONO-)的生成 在手术显微镜下将大鼠的视网膜取下，置于含有二乙基二硫代氨基甲酯的Krebs-HEPES溶液中洗2次，切成碎片，以1-羟基-3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷为探针，37 ℃条件下孵育30 min，置于冰上停止反应，取50 μl反应溶液置于一次性玻璃毛细管中，使用BenchTop电子顺磁共振分光光度计e-scan R(德国)检测组织样品中OONO-的生成。

1.7 蛋白表达的检测 取小鼠睾丸，加入1 ml的RIPA 裂解液中匀浆,经4 ℃、15 000 r/min离心15 min，吸取上清；测浓度后，95 ℃条件下实现蛋白变性。制备SDS-PAGE凝胶，以20 μl蛋白每泳道上样品，经8% SDS-PAGE后，100 V 1 h电转移至硝酸纤维膜。用5%脱脂奶粉封闭。依次加入目标蛋白的一抗iNOS、eNOS、nNOS蛋白及辣根过氧化物酶标记的二抗β-actin和二抗，ECL显色剂显色，用GIS系统定量扫描灰度值。以同一标本β-actin的产物光密度值作为内参,校正各自目的蛋白的积分光密度值,按公式(相对值= 目标蛋白表达强度/β-actin表达强度)计算出相对值。

1.8 统计学处理 所有计量数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 12.0统计软件分析，非配对t检验分析进行组间差异显著性检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精子数目与活力及睾酮浓度的变化 口服摄入酒精15周后，小鼠附睾中的精子数目明显降低[(394±64)×106/ml比(221±55 )×106/ml]，(P<0.05)。见图1A；精子活力明显下降[(54±13)%比(23±8)%](P<0.05)。见图1B。血清和睾丸中睾酮明显下降[血清：(1.234±0.242)μg/L比(0.657±0.260)μg/L](P<0.05)；[睾丸：(1.784±0.242)μg/L比(0.894±0.181)μg/L](P<0.05)。见图2。

注：与对照组比较aP<0.05图1 口服摄入酒精15周后，附睾中精子数目和精子活力降低

注：与对照组比较aP<0.05图2 口服摄入酒精15周后，睾丸组织中和血清中睾酮浓度降低

2.2 睾丸中NO和OONO-含量的变化 口服摄入酒精15周后，小鼠睾丸中NO含量明显增加[(117±22)μmol/g比(253±35)μmol/g](P<0.05)。见图3A；OONO-生成明显增加[(5.32±1.12)μmol/(g·min)比(11.72±2.64)μmol/(g·min)](P<0.05)。见图3B。Western blot检测结果显示睾丸中eNOS蛋白表达变化不明显(0.93±0.09比1.00±0.11)(P>0.05)，iNOS蛋白的表达(3.24±0.43比1.00±0.14)(P<0.05)和nNOS表达(1.87±0.26比1.00±0.12)(P<0.05)明显增加。见图4。

注：与对照组比较aP<0.05图3 口服摄入酒精15周后，睾丸中NO含量和OONO-生成增加

注：与对照组比较aP<0.05图4 口服摄入酒精15周后，睾丸中nNOS、eNOS和iNOS蛋白表达的变化

3 讨论

本研究的结果发现，长期的高剂量酒精摄入导致小鼠精子损伤严重，精子生成数目减少，活力降低，睾酮的合成降低，这一系列数据证明酒精摄入的确对成年雄性小鼠生殖系统造成明显的损伤。

进一步的研究还发现长期的高剂量酒精摄入后，睾丸中NO含量明显增加，而其起因是iNOS和nNOS蛋白表达水平的增加。

NO是一种极不稳定的化合物，实验条件下的半衰期大约3～5 s，高度脂溶性，极易通过生物膜，可自由扩散进入周围的靶细胞，对于调节哺乳动物生殖系统功能具有极其重要的作用[3-5]。

NO对成年雄性小鼠生殖系统的影响主要通过2种途径。首先，过多的NO一方面会与过氧化物反应生成OONO-，导致精子细胞膜脂质氧化造成损伤，另一方面它也会抑制细胞三羧酸循环系统的一系列酶的活性，从而抑制细胞的有氧呼吸[6-7]。其次，NO是睾酮的负向调控因子，睾丸中NO合成增加，会抑制睾丸间质细胞的睾酮分泌能力[8-9]，从而减少小鼠体内睾酮水平，间接抑制了成年雄性小鼠生殖系统的功能。临床试验发现在无精症患者睾丸中iNOS表达水平异常高[10]，也从另一方面暗示了长期的酒精摄入诱导的iNOS表达增加对精子生成的潜在危险。nNOS/NO被报道主要参与对血睾屏障中细胞间紧密连接的调控，而过多的NO会破坏血睾屏障中细胞间紧密连接[11]，从而进一步损伤睾丸的功能。

综上所述，长期的酒精摄入后，成年雄性小鼠睾丸中iNOS和nNOS蛋白表达增加，睾丸中NO合成增加，因为NO的精子毒性作用和抑制睾酮分泌作用，从而最终导致了成年雄性小鼠生殖系统功能的损伤。

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(本文编辑：彭润松)

Mechanism of alcohol-induced damage involving nitric oxide in the reproductive system of male mice

GongJianjun,SunJunfeng,ZhangZhongming,ZhuJianming

(GulangyuSanatorium,NanjingMilitaryAreaCommand,Xiamen361002,China)

Objective To investigate the underlying mechanism of alcohol-induced damage involving nitric oxide (NO) in the reproductive system of male mice.Methods C57BL/6J male mice (10 weeks old) were randomly divided into 2 groups: the control group (orally treated with 10% sucrose daily for 15 weeks) and the alcohol group (orally treated with 8 g/kg daily for 15 weeks). Fifteen weeks later, epididymises were collected for the observation of sperm number and activity. At the same time, blood samples were taken to detect the level of serum testosterone. Testes were also collected for the detection of serum testosterone levels, the levels of NO and OONO-, as well as the expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), and neural nitric oxide synthase (nNOS). Results As compared with that of the control group (221±55)×106/ml)(P<0.05), the number of sperms in the animals of the alcohol group was obviously decreased (394±60)×106/ml) (P<0.05), and the activity (P<0.05) of sperms in the animals of the alcohol group was also decreased (54±13)%, as compared with(23±8)% of the control group(P<0.05). Laboratory tests also revealed that the levels of testosterone in serum and testes were all decreased (P<0.05). The levels of NO and OONO-were all increased in the alcohol-treated mice (P<0.05), and the expression levels of iNOS and nNOS were also up-regulated in the testes of the alcohol-treated mice.Conclusion Enhanced synthesis of NO in the testis of male mice following prolonged consumption of alcohol was one of the important mechanisms involved in the injury of the reproductive system of adult male mice.

Alcohol; Nitric oxide; Male reproductive system; Mouse

361002 福建 厦门，南京军区鼓浪屿疗养院(龚建军、张忠明、朱建明)；福建省军区厦门警备区医院(孙俊峰)

张忠明，电子信箱：123014617@qq.com

R697

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2015.05.012

2014-11-26)