缬沙坦抑制内质网应激对糖尿病肾损害大鼠足细胞的保护作用

魏 静，张建荣

缬沙坦抑制内质网应激对糖尿病肾损害大鼠足细胞的保护作用

魏 静1，张建荣2

目的 探讨缬沙坦对糖尿病肾损害大鼠肾脏足细胞凋亡及内质网应激标志性蛋白GRP78、caspase12表达的影响。方法 将雄性SD大鼠随机分为正常对照组和实验组。实验组大鼠给予腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，然后随机将其分为模型组和缬沙坦组，正常对照组和模型组1次/d给予反渗水灌胃，缬沙坦组1次/d给予缬沙坦(8 mg/kg)灌胃，时间为6周。对nephrin、GRP78、caspase12表达水平进行分析，同时观察血糖、血尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白定量等指标。结果 建模第6周，模型组大鼠肾脏较正常对照组凋亡细胞数明显增多，模型组GRP78(6.75±0.65)及caspase12(11.51±0.32)表达较正常对照组GRP78(1.57±0.39)、caspase12(2.66±0.57)增强(P<0.05)，模型组nephrin(2.29±0.15)较正常对照组(5.71±0.53)表达减少(P<0.05)。缬沙坦组较模型组凋亡细胞数减少，GRP78(3.14±1.00)、caspase12(8.08±2.48)表达减弱(P<0.05)，nephrin(3.35±0.40)表达减少较轻(P<0.05)。结论 缬沙坦通过减缓内质网应激并可能通过抑制内质网特有的caspase12凋亡途径，减少足细胞的凋亡，从而发挥对糖尿病肾病的保护作用。

糖尿病肾病；内质网应激；足细胞凋亡；nephrin蛋白；缬沙坦

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症，蛋白尿是其主要临床表现，也是引起肾脏损伤的独立危险因素。因此,对于蛋白尿发生机制的研究尤为重要。肾小球脏层上皮细胞足细胞损伤、凋亡在蛋白尿的发生发展过程中起着重要的作用。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡通路是近年来新发现的一条重要的凋亡途径。血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ，AT2)可以通过血流及非血流动力学因素在糖尿病肾病发生发展过程中起重要作用，缬沙坦为血管紧张素受体阻滞药 (angiotensin receptor blocker，ARB),通过阻断AT2与其受体结合从而起到肾脏保护作用。内质网(endoplasmic reticulum，ER)是细胞内的一个精细的膜系统，对维持细胞内稳态起重要作用。其基本生理功能包括蛋白质的合成转运、信号肽识别、糖基化修饰等。内质网提供了高保真质量控制系统以保证只有正确折叠的蛋白才可以被运输到内质网外。内质网的内稳态失衡时即ERS。缬沙坦的保护作用是否可能通过抑制ERS继而减少肾脏足细胞凋亡而实现？本研究通过观察缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏足细胞凋亡以及ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白(glucose regulate protein78，GRP78)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12 (caspase12)的影响，旨在研究此种保护作用是否可以通过减少细胞凋亡实现，继而以阻断或抑制内质网应激通路为契点发现新的治疗糖尿病肾病的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只8周龄SD雄性大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 药物与试剂 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ，Sigma 公司)、兔抗鼠GRP78抗体(武汉博士德生物工程公司)、兔抗鼠nephrin抗体(武汉博士德生物工程公司)、兔抗鼠caspase12抗体(武汉博士德生物工程公司)、缬沙坦(8 mg/kg，商品名代文，北京诺华制药有限公司)。

1.3 实验仪器 电子天平(上海天平仪器厂，型号HA 1004)、超速离心机(日本日立公司，型号CP80WX)、全自动生化分析仪(日本日立公司，型号7080型)。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制备及给药方法 随机选取10只大鼠作为正常对照组，余20只大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ) 50 mg/kg ，用pH4.28枸橼酸钠缓冲液配制。48 h后血糖≥16.7 mmol/L，尿糖3+至4+确定为糖尿病模型。将20只大鼠随机分为模型组(10只)、缬沙坦组(10只)。缬沙坦组每天按8 mg/kg灌胃，正常对照组和模型组只灌反渗水。实验期间动物自由进水、饮食，不使用胰岛素及其他降糖药物。

1.4.2 观察指标 实验期间，每日观察大鼠的饲料消耗情况，饮水量、尿量、毛发及体重变化情况。于第6周称重后用代谢笼收集24 h尿，3%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，分离血清，测定血糖 (blood glucose，BG)、血尿素氮 (blood urea nitrogen，BUN)、肌酐 (creatinine，Cr)、24 h尿蛋白定量。切取肾脏，称重后部分置于福尔马林溶液中留做HE染色，部分留做冰冻标本用于western blot。肾组织病理学观察：肾组织石蜡包埋后切片4 μm，常规HE染色，光镜下观察肾组织形态学改变。

Western blot 检测nephrin、GRP78和caspase12蛋白的表达：取肾皮质组织放入冰冷的研磨器，加入蛋白裂解液提取蛋白，用酶连法测定蛋白定量，-70 ℃保存，每个样品取5 μl总蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳后电转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭摇床振荡2 h，4 ℃封闭过夜，再分别加入兔抗nephrin、GRP78、caspase12抗体、鼠抗GAPDH抗体孵育过夜。ECL化学发光法显色。Western blot信号强度应用Image J软件对Western条带进行定量分析，以目的条带和GAPDH条带积分光密度值比值作为最终结果。

1.5 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett′T检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 造模成功后，与正常对照组相比，模型组、缬沙坦组大鼠精神萎靡，毛色暗淡，反应迟缓，多饮、多尿、多食、消瘦等症状明显。给予缬沙坦后，缬沙坦组上述情况均有改善。

2.2 生化指标 模型组大鼠BG维持在较高水平；24 h尿蛋白定量、Cr水平较正常对照组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，缬沙坦组与模型组相比，上述生化指标均显著降低(表1)。与正常对照组比较，缬沙坦组与模型组大鼠肾重均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，缬沙坦组与模型组比较身重升高明显，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表1 正常对照组和糖尿病肾损害组大鼠血糖、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量的比较 (n=10；±s)

注：与正常对照组相比，①P<0.05；与模型组相比，②P<0.05

表2 正常对照组和糖尿病肾损害组大鼠肾重、身重、 肾重/身重的比较 (n=10；

注：与正常对照组相比，①P<0.05；与模型组相比，②P<0.05

2.3 对DN大鼠肾脏组织病理改变的影响

2.3.1 HE染色 HE染色显示，正常对照组大鼠肾小球球囊壁光滑，未见增生及纤维化。毛细血管丛呈小叶状分布，毛细血管腔清晰，肾小管管腔规则，管壁上皮细胞未见肿胀、坏死及脱落，间质无炎细胞浸润，无纤维组织增生。模型组大鼠见肾小球体积增大，基底膜增厚及系膜基质增多，肾小球内可见散在炎细胞浸润。部分毛细血管腔受压变窄，部分肾小管上皮细胞胞浆疏松，轻度水肿。缬沙坦组部分毛细血管丛基底膜稍增厚及系膜区稍增宽，肾小球内炎细胞浸润较模型组减少。肾小管及间质病变不明显(图1)。

图1 正常对照组和糖尿病肾损害组大鼠光镜下肾脏病理(HE×200)

2.3.2 Western蛋白印迹结果 与正常对照组相比，模型组nephrin表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，GRP78和caspase12蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组相比，缬沙坦组nephrin表达上调，GRP78和caspase12蛋白表达水平则降低，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 正常对照组和糖尿病肾损害组大鼠肾脏组织的

3 讨 论

足细胞是肾小球中一种独特、终末分化的细胞，分化成熟后一般不会再生。糖尿病时，高血糖、高血压等多种因素可导致足细胞脱落或凋亡，继而出现尿蛋白。足细胞相邻的足突之间有直径为30～40 nm的裂孔，孔上覆盖一层厚4～6 nm的隔膜，即裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)。SD的完整性决定肾小球滤过屏障的通透性。Nephrin特异地表达于足细胞，并定位于其SD区域，是构成肾小球滤过屏障的关键分子，其表达及分布异常会导致不同程度蛋白尿的发生。研究证实，人类DN时nephrin mRNA及其蛋白表达下降，继而可以引起足细胞及裂孔隔膜的结构和功能损伤，并随肾脏病变的恶化进一步加剧[1]。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组nephrin蛋白的表达下降，同时肾功能发生变化，提示在糖尿病肾病过程中SD区域的nephrin表达及结构的变化可引起足细胞结构、功能改变，继而导致肾小球滤过屏障被破坏、出现蛋白尿及肾功能损害。

凋亡是足细胞丢失的主要原因，在糖尿病肾病早期即可发生[2,3]。内质网(ER)是控制蛋白质量的场所。多种因素均可引起ER内稳态失衡，即内质网应激(ERS)。适度的内质网应激能增强细胞的存活能力，时间过长、过强的ERS则会诱导细胞凋亡。内质网应激在生理和病理情况下均会存在，且是细胞凋亡的重要诱导因子[4]，它不仅可以导致蛋白尿，还在蛋白尿导致的肾功能损害中发挥重要作用[5]。研究表明，由内质网应激导致肾细胞凋亡进而在DN进展中发挥着重要作用[6]。本研究结果表明，6周末DM大鼠肾组织中细胞凋亡数目较正常对照组明显增多，表明肾脏固有细胞过多凋亡可能是导致糖尿病肾脏损害和肾功能进一步恶化的重要原因。

GRP78是内质网分子伴侣蛋白，生理情况下，GRP78在基础水平表达，它被广泛认为是ERS的标志性分子[7,8]。Caspase-12定位于内质网外膜，是介导ERS凋亡的关键蛋白酶，在膜受体或线粒体凋亡途径中不被活化[8,9]。本研究结果表明，6周时，模型组SD大鼠出现明显血糖升高，24 h尿蛋白、肌酐水平升高及肾小球体积增大，基底膜增厚及系膜物质增多、肾小球散在炎细胞浸润、足细胞明显减少等一系列糖尿病肾病表现；而GRP78、caspase12的表达增多均提示肾脏此时处于应激状态，并可能通过caspase12凋亡途径介导足细胞凋亡。但是，我们的研究并未进行凋亡相关的检测，在后续的研究中需进行ELISA、TUNEL等相关检测凋亡的实验。另外，本研究中未进行肾小球面积测量，不能充分证明模型组和缬沙坦组肾小球体积的绝对增大，这是本研究的不足之处。

血管紧张素Ⅱ受体阻滞药(ARB)是目前治疗DN蛋白尿的主要药物。传统研究认为，缬沙坦作为ARB类药物通过阻断AT2与其受体结合而抑制AT2的致病作用，通过血流动力学效应和非血流动力学效应发挥肾保护作用。但近年来研究发现，ARB类药物有独立于降压作用以外的肾脏保护作用。Davis等[10]发现，缬沙坦可阻止动物nephrin表达的下调，其白蛋白尿的程度与nephrin表达呈负相关。同时有研究亦发现，缬沙坦可降低尿蛋白排泄率，并阻止nephrin表达的下调从而起到对足细胞的保护作用，且尿白蛋白排泄率与nephrin表达呈相关性[11]。陈玉凤等[12]发现，替米沙坦对ERS介导的肾脏细胞凋亡有保护作用，能够显著的减少尿蛋白，改善肾功能。

综上所述，缬沙坦组由STZ导致的肾脏病理损害得到了明显改善，24 h尿蛋白定量和Cr也明显下降,表明其对糖尿病肾病时的肾脏保护作用，且这种保护作用可能是通过抑制内质网应激继而减少肾脏足细胞的凋亡起作用的。GRP78、caspase12及生化指标的改变则证实缬沙坦可能通过抑制ERS诱导的凋亡途径参与其在高糖环境下对足细胞的保护作用。进一步检测ERS诱导的凋亡途径在糖尿病肾病中的地位，以及是否可以通过干扰ERS不同环节减少细胞凋亡继而起到肾保护作用仍需继续研究。

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(2015-05-08收稿 2015-07-20修回)

(责任编辑 郭 青)

Protective effect of valsartan on glomerular podocyte apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in diabetic nephropathy rats

WEI Jing1and ZHANG Jianrong2.

1.Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China；2. Department of Nephrology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Beijing 100039，China

Objective To evaluate the effect of valsartan on apoptosis of podocytes，GRP78 which serve as a symbolic protein of endoplasmic reticulum stress (ERS) and caspase12 in diabetic rats. Methods Male SD rats were randomly divided into normal group and study group.The animal models with diabetes were established in study group by STZ intraperitoneal injection,then the study group were randomly divided into model group and valsartan group.Water was aiministered daily by gavage to normal group and model group.Valsartan was administered daily by gavage to valsartan group for 6 weeks. The levels of protein of nephrin、GRP78，caspase 12.BG，Cr ，BUN and 24-hour urinary protein quantity were checked. Results At the time of 6 weeks，compared with those in normal group，the number of apoptosis cells were much higher in the model kidneys，the expression of GRP78(6.75±0.65),caspase 12 (11.51±0.32)in the model kidneys were much higher than GRP78(1.57±0.39)，caspase12(2.66±0.57)in the normal group(P<0.05);however, the expression of nephrin in the model group(2.29±0.15)was lower than in the normal group(5.71±0.53)(P<0.05). While in the valsartan group,reductions were found in the expression of GRP78(3.14±1.00)，caspase12 (8.08±2.48)and the number of apoptotic cells(P<0.05),the expression of nephrin (3.35±0.40)was higher(P<0.05). Conclusions Valsartan can depress the effect of endoplasmic reticulum stress and reduce the apotosis of the podocytes in the development of diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy; endoplasmic reticulum stress; apoptosis; nephrin; valsartan

国家自然科学基金面上项目(81273706)

魏 静，硕士研究生，E-mail:mengyiyuan1256@163.com

1.221004，徐州医学院，2.100039 北京，武警总医院肾内科

张建荣，E-mail:zhangjr0317@126.com

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