尿激酶对家兔心肺复苏后脑神经细胞凋亡的影响

郭晓东，张 巍，郭 静,苏清明，杨贵荣，张 杰，孙 鲲,王立祥

尿激酶对家兔心肺复苏后脑神经细胞凋亡的影响

郭晓东1，张 巍2，郭 静3,苏清明4，杨贵荣1，张 杰1，孙 鲲5,王立祥5

目的 探讨心搏骤停心肺复苏后溶栓药物尿激酶对脑神经细胞凋亡的影响。方法 20只家兔按随机数字表法被分为溶栓组和常规复苏组，每组10只。采用氯化钾注射法结合窒息法致心搏骤停后，常规复苏组只进行心肺复苏及基本生命支持，溶栓组在此基础上给予尿激酶2万U/kg进行干预。通过细胞凋亡原位检测(Tunel)，免疫组织化学法检测半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)以此来证明尿激酶对脑神经细胞凋亡的影响。结果 溶栓组复苏24 h后大脑皮质和海马Tunel和 Casepase-3阳性细胞均明显低于常规复苏组，Tunnel：皮质29.22±7.86比37.20±7.04(t=-2.392，P=0.028)，海马18.80±7.58比27.4±8.15(t=-2.442，P=0.025)，Caspase-3：皮质22.1±9.93比33.1±12.64(t=-2.165，P=0.044)，海马31.3±15.23比46.8±16.73(t=-2.167，P=0.044)，差异有统计学意义。常规复苏组与溶栓组自主循环恢复时间(s)、自主呼吸恢复时间(min)、平均动脉压(mmHg，)均无明显差异[自主循环恢复时间：307.9±96.4比242.0±71.0(t=-1.741，P=0.099)，自主呼吸恢复时间：20.6±12.5比19.3±10.0(t=-0.256，P=0.801)，平均动脉压：65.5±6.2比69.0±6.7(t=1.217，P=0.239)]。结论 心脏骤停后在心肺复苏时给予溶栓药物尿激酶可以改善并减轻因细胞凋亡所致脑神经损害。

心肺复苏；尿激酶；溶栓；神经细胞凋亡

心肺复苏技术已经历了半个多世纪的理论和实践的探讨，挽救了许多心脏骤停者的生命，但经心肺复苏后的患者总体存活率仍然很低，仅为5%左右[1]，而且脑复苏的成功率更低。心肺复苏后脑功能的恢复代表着复苏的最终成功，然而仅有少部分能达到神经功能一定程度的恢复。据资料显示 ,在洛杉矶院外2000例心脏骤停者中,心肺复苏成功后神经系统完好者仅1.4 %[2]。影响脑复苏的原因很多，其中心搏骤停及心肺复苏后机体存在凝血和纤溶系统功能紊乱、脑血管内微血栓形成，导致脑灌注减少或无灌注是重要原因之一[3-7]。而脑灌注减少或无灌注必然导致较长时间的脑缺血，进而造成脑神经细胞的损伤[8]。因缺血导致的脑神经损伤包括坏死和凋亡。有研究提示，凋亡可能是心跳骤停导致全脑缺血后海马区神经元死亡的主要方式[9]，在心肺复苏的相关研究中，溶栓药物治疗，能改善脑微循环的灌注，减少脑无灌注区的面积，有助于改善神经系统的预后，可提高脑复苏的成功率[10-14]。应用溶栓药物在改善脑灌注的同时，是否对神经细胞凋亡过程产生影响值得研究。本研究旨在探讨心搏骤停后心肺复苏基本生命支持阶段给予溶栓药物并通过细胞凋亡原位检测(Tunel)，免疫组织化学法检测半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)，观察细胞凋亡情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型制备 健康新西兰纯种大白兔20只，兔龄5～6个月，体重2～3 kg，由军事医学科学院实验动物中心提供〔SCXK(军2012-0004)〕，随机分为常规复苏组(n=10)和溶栓组(n=10)。实验兔在术前晚上禁食。术前30 min 给予阿托品0.01 mg/kg肌内注射，称重后给予氯胺酮+速眠新(合剂配比为1 ml∶1 ml) 0.2～0.3 ml/kg肌内注射，麻醉后四肢连接心电导联电极监测心电图，分离股动脉置入小儿心导管，与迈瑞9000多道生理记录仪传感器相连监测动脉血压、平均动脉压。分离股静脉置入BD22G套管针，用于静脉给药。气管切开置入气管插管以备呼吸机应用。参照文献[15，16]采用氯化钾注射法结合窒息法致心搏骤停动物模型，经股静脉弹丸式注射4 ℃的10%氯化钾(7 mg/100 g)，待心搏骤停后，于呼气末夹闭气管导管。心搏骤停标准为动脉压波形消失且平均动脉压<20 mmHg，心电图示窦性心律消失，出现室颤波或一直线，听诊心音消失，持续3 min后开始复苏。复苏方法：松开夹闭的气管导管，连接小动物呼吸机，给予机械通气，呼吸频率40次/min，潮气量20 ml/kg。胸外按压150～180次/min，各组均于复苏开始静脉注射肾上腺素0.02 mg/kg。每5 min给药1次，重复3次，复苏30 min后自主循环未恢复者结束观察，表明复苏失败。溶栓组在开始复苏时给予尿激酶2万U/kg+NS30 ml于30 min内静脉滴完[17]， 常规复苏组在开始复苏时给予生理盐水30 ml于30 min内静脉滴完。自主循环恢复后，继续给予机械通气，直到恢复自主呼吸后停止机械通气。复苏后24 h，再次以氯胺酮+速眠新麻醉，开胸在右心耳处剪一小孔，经左心室穿刺灌注0.9%生理盐水至血液变清，然后灌注4%多聚甲醛，断头后剥离出脑组织，放入4%多聚甲醛液中常温固定，脑组织标本用石蜡包埋并切片。

1.2 观测指标

1.2.1 自主循环恢复时间 判断标准为在无胸外按压时，收缩压在60 mmHg以上维持10 min，表示自主循环恢复[18 ]。

1.2.2 自主呼吸恢复时间 以出现腹式呼吸，撤掉呼吸机后持续5 min为自主呼吸恢复的标志。

1.3 免疫细胞化学染色检测及结果判断

1.3.1 Casepase-3 (1)试剂：Casepase-3免疫组化试剂盒由迈新公司提供。辅助试剂有磷酸盐缓冲液(PBS)；枸椽酸盐缓冲液(CB)等。(2)操作规程：组织切片常规脱蜡，水化，PBS缓冲液洗涤切片，采用加热法修复抗原后，待修复液自然冷却至室温；1×PBS缓冲液洗涤切片；在组织切片上3%H2O2滴加(以PBS缓冲液或甲醇配置)； PBS洗2～3次各5 min；滴加正常山羊血清封闭液；滴加第一抗体50 μl，置于湿盒内，4 ℃过夜；1×PBS洗3次各5 min；滴加复合二抗(HRP-Polymer anti ms/rb IgG)，室温静置20 min；1×PBS洗3次各5 min；DAB显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，脱水,透明：中性树胶封片，镜检(具体过程详见试剂盒说明)。(3)观测方法：胞浆有棕黄色颗粒状染色者为阳性细胞。应用Olym pus BX-51光学显微镜，400倍镜下随机选取10个不重复的视野，由图像分析系统计数阳性细胞，取均值作为该张切片阳性细胞数。

1.3.2 Tunnel染色 (1)试剂：PBS(磷酸盐缓冲液pH7.2～7.4)；C1017 Hoechst 33258染色液。(2)操作规程：抗原/切片的准备：切片厚度3 μm，60～65 ℃烤片2 h；切片脱蜡，水化，依次为二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→85%乙醇→75%乙醇各10 min；PBS浸泡10 min；直接加Hoechst 33258染色液，染色5 min，封片，荧光显微镜下观察采图。(3)观测方法(400倍)：以HOST23358染色观察凋亡情况，有凋亡的细胞核出现浓缩或碎裂表现。

2 结 果

2.1 镜下观察 复苏24 h后荧光显微镜观察两组大脑皮质和海马Tunel细胞核出现浓缩或碎裂表现，常规复苏组可见皮质区与海马区有少数神经元发生凋亡，溶栓组凋亡细胞数目明显减少；光学显微镜观察 Casepase-3阳性细胞呈现棕褐色，棕色团块主要分布在细胞质，少数细胞核中也可见表达，常规复苏组可见皮质区与海马区有少数神经元胞浆内有棕色阳性物质，溶栓组阳性细胞数目明显减少(图1，2)。大脑皮质和海马Tunel和 Casepase-3阳性细胞计数，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 家兔溶栓组和常规复苏组Tunel阳性细胞的表达(Tunnel染色，×400)

图2 家兔溶栓组和常规复苏组Casepase-3阳性细胞(Casepase-3染色，×400)

注：与常规复苏组比较，①P<0.05。

2.2 其他观察指标 自主循环恢复时间、自主呼吸恢复时间及平均动脉压，两组比较差异无统计学意义(表2)。

表2 家兔溶栓组和常规复苏组观察指标比较 (n=10；±s)

3 讨 论

心脏骤停和心肺复苏后，由于血液淤滞、缺氧、酸中毒及血管内皮损伤等因素激活了凝血系统，机体出现凝血和纤溶系统功能紊乱，使脑血管内大量微血栓形成，造成脑微循环灌注不良[19-23 ]。自主循环恢复后，脑灌注不足仍继续，即存在无复流现象，而继续加重脑损伤[24]。早期脑微循环灌注不足是引起复苏后脑功能损伤的重要原因之一。完全性脑缺血后, 神经系统的细胞死亡可以通过多种机制发生，主要分为凋亡和坏死两种截然不同的方式，脑组织长时间缺血后，数分钟或数小时内出现神经元和胶质细胞的快速死亡，即坏死；而缺血中心区周围的半暗区表现为选择性神经元缺失，持续时间较长,称迟发性死亡，即凋亡。但另有研究报告，缺血中心区的死亡神经元极少完全表现为坏死特征，而细胞凋亡的特征在绝大多数神经元中都存在[25 ]。因此，有学者提出缺血早期，部分缺血中心区细胞可能首先发生细胞凋亡。脑缺血是常见的凋亡刺激因素，可以导致神经元细胞内凋亡与抗凋亡反应机制同时激活：当刺激较小时，以抗凋亡为主；而当刺激较大时，则以凋亡为主。细胞缺血缺氧后的凋亡通路主要是依赖半胱天冬蛋白酶 (cysteine - asparateprotease, caspase)的线粒体途径和激活死亡受体途径，在神经元细胞凋亡过程中起重要作用的Caspase家族成员是Caspase-3[26 ]。有研究提示，肝素及溶栓药物能够在一定程度上延缓早期心肺复苏阶段组织微循环血流灌注的恶化[27 ]，本实验在活体家兔心脏骤停和心肺复苏过程中单独给予尿激酶(排除肝素对组织微循环血流灌注的影响)治疗，并通过细胞凋亡原位检测(TUNEL)，免疫组织化学法检测Caspase-3，观察溶栓药物对脑神经细胞凋亡的影响。

在本研究中，溶栓组与常规复苏组在自主循环恢复时间、自主呼吸恢复时间，以及平均动脉压方面，没有明显的差异，说明心肺复苏后两组存在相同的微循环障碍。但是，溶栓组在自主循环恢复时间较常规复苏组缩短，考虑尿激酶溶解微血栓,使微循环保持相对通畅有关[28]，溶栓组自主循环恢复时间较早，对脑血流及微循环的恢复亦产生有利影响。再灌注24 h后常规复苏组Tunel阳性神经细胞及caspase-3蛋白阳性表达明显高于溶栓(尿激酶)溶栓组，两组存在明显差异。说明在心脏骤停和心肺复苏过程中给予溶栓(尿激酶)治疗可以减少细胞凋亡，减轻神经细胞损伤。分析原因如下：溶栓药物可以有效作用于心搏骤停后大脑微血管栓子，通过溶解微血栓，改善脑微循环的灌注，减少脑无灌注区域面积，改善神经系统的预后[30，31]。郭晓东等[28]对大鼠进行复苏实验发现心跳、呼吸骤停5～8 min即可造成脑血管内大量微血栓形成及脑神经细胞变性、坏死，给予尿激酶干预可以降低脑神经细胞损伤程度，改善预后。Aliyev等[31]报道，家兔心搏骤停后在心肺复苏的BLS阶段微循环血流量下降，有血细胞聚集现象，给予溶栓、抗凝药物的干预可以改善早期心肺复苏阶段组织的微循环血流灌注，防止微循环内微血栓形成。

本实验通过在活体家兔心脏骤停和心肺复苏过程中给予尿激酶治疗，常规复苏组TUNEL阳性神经细胞及caspase-3蛋白阳性表达明显高于溶栓组，两组存在明显差异。提示尿激酶溶栓治疗可以明显改善并减轻心脏骤停和心肺复苏后因脑缺血、血氧而造成的脑神经损害，进而提高脑复苏的成功率。

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(2015-05-11收稿 2015-09-15修回)

(责任编辑 岳建华)

Influence of urokinase on nerve cell apoptosis after cardiopulmonary resuscitation in rabbits

GUO Xiaodong1, ZHANG Wei2, GUO Jing3, SU Qingming4, YANG Guirong1，ZHANG Jie1，SUN Kun5，and WANG Lixiang5.

1.The First Department of Critical Care Medicine, 3. Department of Medical Care, 4. Department of Pathology , 5. Department of Emergency，General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039,China；2. Out-patient Department, Department of Information, General Staff Headquarters, Beijing 100840, China

Objective To investigate the effect of urokinase on nerve cell apoptosis after cardiac arrest(CA) and cardiopulmonary resuscitation(CPR)in rabbits. Methods 20 rabbits were randomly divided into experimental group and control group, 10 rabbits in each group. Potassium chloride injection combined with asphyxia method was conducted to establish the CA models. CPR and basic life-support were performed in experimental group. Based on above treatments, intervention with urokinase (20 000 U/kg) was conducted in experimental group. Neural apoptosis was identified by TUNEL and caspase-3 was detected by immunohistochemistry in order to prove the effect of urokinase on nerve cell apoptosis in rabbits 24 hours after CPR. Results Tunel and caspase-3 positive cells counts of cerebral cortex and hippocampus in experimental group were significantly less than those in control group, respectively. The comparisons were as follows(Tunel positive cells in cerebral cortex 29.22±7.86: 37.20±7.04(t=-2.392，P=0.028), in hippocampus 18.80±7.58: 27.4±8.15(t=-2.442，P=0.025), Caspase-3 positive cells in cerebral cortex 22.1±9.93:33.1±12.64(t=-2.165，P=0.044)，in hippocampus 31.3±15.23vs46.8±16.73(t=-2.167，P=0.044); so thrombolytic therapy with urokinase can relieve nerve cell apoptosis obviously. Comparison of spontaneous circulation restoration time(s) 307.9±96.4: 242.0±71.0(t=-1.741,P=0.099), spontaneous breathing restoration time(min) 20.6±12.5:19.3±10.0 (t=-0.256,P=0.801), mean arterial pressure MAP (mmHg) 65.5±6.2: 69.0±6.7 (t=1.217,P=0.239), there were no differences between the experimental group and control group. Conclusions Thrombolytic therapy with urokinase in CPR after CA can improve and lessen nervous lesion resulting from apoptosis in rabbits.

cardiopulmonary resuscitation；cardiac arrest ；urokinase, caspase-3； Tunel；nerve cell apoptosis

全军医学科技“十二五”课题计划(BWS11J077)；武警总医院一类课题(WZ2008001)

郭晓东，本科学历，副主任医师，E-mail:guoxiaodong59122@sina.com

100039 北京，武警总医院：1.重症医学一科，3.医疗科，4.病理科，5.急救医学中心；2. 100840 北京，总参信息化部门诊部

郭 静， E-mail:18610420911@163.com

R605.974