Smad3和Smad7蛋白在硬皮病患者皮损中的表达及意义*

西安交通大学第一附属医院皮肤科( 西安710061)

刘文丽 张 键 穆 欣 刘 彤△

Smad3和Smad7蛋白在硬皮病患者皮损中的表达及意义*

西安交通大学第一附属医院皮肤科( 西安710061)

刘文丽 张 键 穆 欣 刘 彤△

目的: 探讨Smad3和Smad7在硬皮病发病机制中的作用。方法: 采用免疫组化SP法检测46例硬皮病患者皮损中Smad3与Smad7蛋白的表达，以15例正常皮肤组织作为对照。结果: 与对照组相比，Smad3蛋白在硬皮病患者皮损中明显升高(P<0.01)，Smad7蛋白表达则降低(P<0.01)；正常对照组皮肤中，Smad3与Smad7表达呈正相关(r=0.679，P<0.01)，而硬皮病患者皮损中无相关性(P>0.05)。结论：Smad3表达上调与Smad7下调可能促进了硬皮病纤维化的发展。

硬皮病( Scleroderma, SD)表现为局限性或弥漫性皮肤和内脏器官胶原结缔组织进行性纤维化硬化、萎缩为特点的一种结缔组织疾病。目前研究发现转化生长因子-β(Transforming growth factor β， TGF-β)在SD发病中起重要作用，与纤维化关系密切，但具体作用机制尚未明确，可能与TGF-β/Smads信号传导途径中各个环节异常有关。Smad3与Smad7是该信号转导通路中的重要分子，参与介导多种纤维化疾病的发生。本文通过免疫组织化学SP法检测SD组织Smad3和Smad7蛋白的表达，探讨其在SD发病中的作用。

材料和方法

1 材 料 ①标本：收集临床和病理确诊、未经治疗的SD皮肤标本共46例。以上标本来源于2009年2月至2012年6月西安交通大学第一附属医院皮肤科门诊和住院SD患者。15例正常对照来源于同期我院整形外科及骨科手术切除的健康正常皮肤。正常对照组与SD患者性别、年龄无统计学差异。②试剂：兔抗人Smad3和Smad7多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉生物有限公司。

2 方 法 标本常规石蜡包埋制成连续5μm切片，采用免疫组化SP法进行染色。石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸微波修复，3% H2O2封闭内源性过氧化酶；滴加正常山羊血清工作液室温孵育20 min，滴加兔抗人Smad3和Smad7抗体(1∶100)，4℃过夜；滴加生物素标记山羊抗兔IgG工作液；滴加SP复合物；DAB显色剂显色，苏木素复染细胞核，脱水、透明，中性树胶封片。每次实验均设立阴性对照，实验过程中用PBS缓冲液代替一抗做为阴性对照。

3 结果判定 结果判定标准根据Shimizu法[1]改良而成。在显微镜下(40×10倍)随机选取5个视野(每个视野计数100个细胞)，按照阳性细胞所占百分比(阳性率)及染色强度分级评分。根据阳性率分为4级，阴性为0分，阳性率<20%为1分，20%～50%为2分，>50%为3分；根据染色强度分为3级：无着色为0分，浅着色为1分，深着色为2分；上述两项积分相加：<2分为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3分为阳性(++)，≥4分为强阳性(+++)。

4 统计学方法 所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，两组间比较采用Mann-WhitneyU秩和检验。两变量之间相关分析采用Spearman秩相关。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Smad3和Smad7蛋白在SD组与对照组的表达 Smad3、Smad7蛋白在正常组织血管内皮细胞、成纤维细胞及角质形成细胞均有表达。Smad3在硬皮病组织中表达增强，而Smad7减弱(见附表)。

附表 Smad3、Smad7蛋白在SD组与对照组间的比较

注：Z值Mann-Whitney 检验，SD组与正常对照组比较

2 Smad3与Smad7蛋白表达的相关性分析 正常对照组皮肤中Smad3与Smad7蛋白范围强度呈正相关(r=0.679，P<0.01)；而硬皮病患者皮损中Smad3与Smad7间无相关性(P>0.05)。

讨 论

TGF-β在SD发病机制中起关键作用。Smad表达异常参与肺、肝及肾脏等器官纤维化过程已被研究证实。根据其结构和功能Smad被分为受体活化型，通用调节型和抑制型三种，其中Smad3属于受体活化型，参与多种基因的转导。Smad7属于抑制型Smad，组成TGF-β/Smad信号环路的负性调节信号。

Smad3增加不仅通过增加胶原的合成，而且通过减少金属蛋白酶的降解和增加金属蛋白酶抑制剂的合成促进纤维化的发生。许多纤维化动物模型的报道亦说明Smad3的丢失导致了纤维化反应的减轻。Dong和李江涛、赵会平等[2～4]发现SD皮损中Smad3蛋白的表达升高，此外Mori等[5]在体外培养的SD成纤维细胞中亦证实Smad3蛋白水平增加。本研究显示SD患者皮损中Smad3蛋白表达升高，得出与上述研究相类似的结果。这说明Smad3水平升高可能是导致TGF-β作用增强，胶原过度沉积及组织纤维化的重要因素。TGF-β可以诱导抑制型Smads的转录，表明抑制型Smads可以作为TGF-β/Smad信号转导自我调节的一种负反馈信号。Dong[2]在体外培养SD成纤维细胞中发现基础水平及TGF-β诱导Smad7的表达能力明显受损，而通过转染Smad7恢复了SD成纤维细胞正常TGF-β信号，提示Smad7降低在TGF-β致纤维化中发挥重要作用。本研究发现Smad7蛋白表达低于对照组，Smad7水平降低导致成纤维细胞在TGF-β刺激下过度活化。然而Asano[6]及国内赵会平[4]报道SD皮损中Smad7是升高的，可能与其对TGF-β的抑制作用在SD中遭到了破坏有关。上述这些结果的差异有待于我们进一步研究。

正常情况下，细胞内TGF-β/Smad信号激活在时间及空间上是紧密配对的，信号激活的同时伴随有抑制信号的发生，即Smad3激活同时抑制型Smad7转录增加。本研究发现，正常对照组皮肤中Smad3与Smad7呈正相关，而硬皮病患者皮损中Smad3与Smad7间无相关性，二者间变化的不同步性打破了TGF-β环路的内在平衡，这就为SD发病过程中成纤维细胞对TGF-β的高应答性、信号的持续激活及表型的变化提供了基础，这可能是SD纤维化不断进展的重要因素。

[1] Shimizu M, Ssitoh Y, Itoh H,etal. Immunohistochemical staining of ha-ras oncogene product in normal, benign, and malignant human pancreatic tissues[J]. Human Pathol, 1990, 21(6): 607-613.

[2] Dong C, Zhu S, Wang T,etal. Deficient Smad7 expression: a putative molecular defect in scleroderma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(6): 3908-3913.

[3] 李江涛, 杨南萍, 陈永涛，等. TGF-β1/Smads细胞因子硬皮病皮肤组织上的表达研究[J]. 四川大学学报： 2007, 44(3): 692-696.

[4] 赵会平, 肖 嵘, 罗勇奇，等. 硬皮病皮损中TGF-β1, Smad3和Smad7的检测及意义[J]. 中国皮肤性病学杂志,2007, 21(4): 213-215.

[5] Mori Y, Chen SJ, Varga J,etal. Expression and regulation of intracellular Smad signaling in scleroderma skin fibroblasts[J]. Arthritis Rheum, 2003, 48(7): 1964-1978.

[6] Asano Y, Ihn H, Yamane K,etal. Impaired Smad7-Smurf-mediated negative regulation of TGF-beta signaling in scleroderma fibroblasts[J]. J Clin Invest, 2004, 113(2): 253-264.

(收稿：2015-05-20)

The expression and significance of Smad3 and Smad7 protein in skin lesions of patients with scleroderma Department of Dermatology, the First Affiliated Hospital, of Xi’an Jiao tong University

( Xi’an 710061)

Liu Wenli Zhang Jian Mu Xin et al

Objective: To investigate the roles of Smad3 and Smad7 protein in the pathogenesis of scleroderma. Methods: The expression of Smad3 and Smad7 in skin lesions from 46 patients with scleroderma and skin from 15 normal controls were detected with Immunohistochemistry SP assay. Results: Compared with controls, Smad3 protein in scleroderma lesions were increased (P<0.01), however, Smad7 were decreased (P<0.01). In normal tissues Smad3 was positive correlated with of Smad7(r=0.679，P<0.01). But there was no correlation in skin lesions of scleroderma(P>0.05). Conclusion: Smad3 up-regulation and Smad7 down-regulation maybe involve in the progression of fibrosis in scleroderma.

Scleroderma,Limited @Smad3 @Smad7

*陕西省科技攻关项目(2014K11-02-03-13)

硬皮病，局限性 @Smad3 @Smad7

R593

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.031

△通讯作者