牙髓血运重建术对延迟再植牙根部组织bFGF及PDGF表达的影响*

西安市中心医院口腔科(西安710004)

张 新 刘艳丽∆

牙髓血运重建术对延迟再植牙根部组织bFGF及PDGF表达的影响*

西安市中心医院口腔科(西安710004)

张 新 刘艳丽∆

目的：研究牙髓血运重建术对延迟再植的犬年轻恒牙根部组织碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及血小板衍生生长因子(PDGF)表达的影响。方法：选择4只约5月龄健康杂种犬，取11、13、15、41、43、45恒牙为实验组，对侧同名牙为对照组。1d后实验组再植后行牙髓血运重建术，对照组再植后不做附加处理。软食分笼喂养3、6月时拔除实验牙并取牙槽窝新鲜血液1m1离心，冻融后检测bFGF及PDGF含量并进行统计学分析。结果：术后实验牙有3个未形成血凝块，7个三氧化物凝聚体(MTA)充填不佳，5个出现牙槽骨Ⅱ-Ⅲ°吸收，3个根折。3、6个月时实验组bFGF和PDGF的浓度升高，与对照组比较差异有统计学意义， bFGF浓度无统计学差异(P>0.05)，而PDGF的浓度随时间变化呈有统计学差异。结论：牙髓血运重建术可以促使牙根发育、根尖孔闭合、根管壁增厚。但其长期疗效，生物学机制，以及可能出现的不良影响仍需继续研究。

牙外伤是口腔常见病之一[1]。在牙外伤病例中，牙完全脱位约占12%～26%[2]，牙齿脱落后第一时间不能就诊并且或在保存脱落牙齿方面没有经验会造成患牙缺失，而牙齿再植术后常出现牙根外吸收[3,4]，严重时导致牙槽骨吸收、牙松动、牙脱落而造成治疗失败。牙髓血运重建术(Dental pulp revascularization)是由Iwaya等[5]在2001年首次提出，作为治疗年轻恒牙牙髓感染或坏死的新选择，通过彻底的根管清理、消毒，保护牙髓干细胞和间充质干细胞，为增殖和分化提供良好的环境，并使用MTA进行冠方封闭。当根管内血管再生后，根尖周炎症可以逐渐愈合，出现根尖闭合、牙根长度增加及管壁增厚等现象，但其分子机制仍不明确。本研究拟通过建立犬牙髓血运重建术动物学模型，观察延迟再植的年轻恒牙根部组织碱性成纤维活细胞生长因子(bFGF)以及对血小板衍生生长因子(PDGF)的表达情况以及不同时期牙髓血运重建术bFGF以及PDGF的影响作用，对牙延迟再植术后牙根周组织炎症吸收愈合机制提供理论依据，为深入研究牙髓血运重建术的临床应用奠定基础。

材料和方法

1 实验动物及分组 4只本地约5月龄健康杂种犬，雌雄不限，体重约6kg，选取11、13、15、41、43、45恒牙为实验组(再植后行牙髓血运重建术)，同名对侧牙做为对照组(再植后不做附加处理)。纳入标准：经X线影像确定牙根未发育完成、根尖孔敞开的上颌和下颌单根管牙齿。排除标准：牙根已发育完成、牙冠或牙根存在裂隙。筛选出46颗牙(其中实验组和对照组各1颗下前牙牙根已发育完成，未纳入试验)进行试验。

2 主要试剂和仪器 bFGF、PDGF酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物公司，中国)；MTA(登士柏公司，美国)；牙科X射线机(北京普朗公司，中国)；口腔显微镜(蔡司公司，德国)。

3 实验方法 拔除犬实验牙后静置于生理盐水培养皿中，1d后将实验牙置于2 mmol/L浓度的ALN溶液中浸泡10 min，进行再植。实验组牙齿常规开髓、拔髓、预备至25#针并彻底消毒，将实验组牙植入对应原牙槽窝中，刺激根尖周组织缓慢出血，显微镜下观察出血达到釉牙骨质界后停止刺激，静置15min后观察到血凝块形成后使用MTA垫底封闭和玻璃离子充填修复。对照组牙齿浸泡后直接植入对应原牙槽窝。术后使用羊肠线逐个拉拢缝合唇舌侧牙龈固定牙齿。

4 标本制备 分笼喂养软食3、6月时分别将两只实验狗进行标本制备。首先实验牙拍摄X线片后拔除该牙，牙槽窝取新鲜血液1m1静置于离心管，3h后4000rpm离心15min并用移取血清至空离心管，-70℃保存。标本收集完成后进行检测，以避免试剂和人员产生的误差影响。

5 ELISA检测 按试剂盒要求进行ELISA检测，终止操作后测定各孔的吸光度(OD450值)，每组重复测试3次，计算均值。根据标准品的浓度及OD值计算标准曲线方程后算出样品浓度。

6 统计学方法 运用SPSS方法21.0统计学软件，P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1 临床检验 标本制备的过程中，3颗实验牙刺激后无法形成血凝块，排除本实验。喂养结束时牙齿叩诊呈金属音，牙龈无明显退缩、充血以及水肿，松动1度内的实验牙进行制备。3月时2只实验犬由于损坏或松动脱落共丧失4颗牙齿(实验组1颗，对照组3颗)，最后，实验组10颗，对照组8颗受试牙被纳入进行比较研究；6月时实验组8颗，对照组6颗受试牙进行比较研究。

2 X线观察结果 术前实验牙根尖孔均开放。喂养3月时22个实验牙牙根中有3个MTA充填不佳，2个出现牙槽骨2～3度吸收，1个牙根根折；6月时24个实验牙牙根中有4个MTA充填不佳，3个出现牙槽骨2～3度吸收，2个牙根根折，均不进行标本制备。其余实验牙部分出现根尖孔、牙根管壁厚度缩窄的趋势(图1,图2)。

图1 CBCT再植牙血运重建术后1d 图2 CBCT再植牙血运重建术后6m

3 ELISA检测结果 与对照组比较，实验组3、6个月时bFGF及PDGF的浓度升高，有统计学差异(P<0.05)。实验组组内按时间比较时显示bFGF浓度无统计学差异(P>0.05)，而PDGF的浓度随时间变化呈现统计学差异(P<0.05)，见表1，表2。

表1 不同时间点实验、对照组bFGF浓度水平

注：与对照组比较，*P<0.05

表2 不同时间点实验、对照组PDGF浓度水平

注：与对照组比较，*P<0.05；与3月比较，△P<0.05

讨 论

外伤引起的年轻恒牙脱落会造成牙根停止发育、根管内壁变薄、根尖孔不能闭合等问题。以往的治疗中，脱落牙齿完成根管治疗及再植后使用氢氧化钙或矿化三氧化聚合体(MTA)进行诱导根尖成形，可以促进根尖孔闭合，形成钙化屏障[6,7]，但氢氧化钙的使用容易造成微渗漏和牙根折裂[8]，而MTA的作用是使根尖孔原位关闭、牙齿失去感觉及防御功能，继发性牙本质无法形成，治疗后根管仍然需要充填。但这两种方法均不能促进牙根的继续生长及根管壁增厚[8～10]。

血管再生法是一种治疗死髓、外伤等年轻恒牙疾病的新方法，Banchs等[11]对坏死感染的年轻恒牙联合应用甲硝唑，米诺环素和环丙沙星冲洗液进行彻底消毒，刺激根尖组织出血充盈根管，血凝块形成后采用MTA封闭冠方，术后2年发现根尖病变愈合，根尖闭合以及管壁增厚，部分患者出现牙髓活力反应。近年来的研究表明[12]部分采取血管再生法的病例取得了良好的治疗效果。

牙髓血管再生取得成功的关键包括彻底消毒、良好的血凝块以及严密的冠方封闭。本实验对于实验牙采用ALN溶液浸泡，治疗后又使用3%次氯酸钠液荡洗以保证消毒的彻底。血凝块作为组织生长的支架[13]，含有PDGF、bFGF和组织生长因子等可以刺激未分化的间充质细胞分化的因子。本实验刺激根尖出血时，使用口腔显微镜可以有效的控制血凝块的形成过程，为严密封闭根管提供有效保障。本实验有3颗实验牙未形成血凝块，分析可能原因有：①过强的根尖刺激，无法控制出血量；②药物刺激性过强造成根尖感染：③局部血运不佳无法形成血凝块。MTA的正确使用是冠方封闭的保证， MTA一般充填在根管口下方2～3mm的釉-牙骨质界。本实验共有7个MTA充填不良而失败的牙齿，推测可能是因为犬牙冠部为锥形，根管口的直径小且移行不明显，操作不当或血凝块质量不佳都有可能造成MTA推进根管的情况。

bFGF是一种肝素粘合多肽的成纤维生长因子，具有促进创伤组织愈合，修复软硬组织等作用。相关研究表明， bFGF 与牙本质基质的沉积及成釉细胞 成牙本质细胞的分化成熟有关。PDGF是一种多肽生长因子，参与各种炎症反应、细胞增殖以及组织修复等过程，也可与破骨细胞受体结合促进破骨细胞对骨的吸收，同时诱发释放前列腺素类物质促进血管扩张，使局部组织发生充血反应，有利于伤口早期修复。同时，PDGF也是一种促进有丝分裂以及生物趋化因子，可调节成骨细胞功能，刺激成骨细胞复制，降解胶原，促进骨形成。本实验通过ELISA实验检测不同时期牙槽窝新鲜血液中bFGF和PDGF的含量，结果显示实验组3、6个月时bFGF和PDGF的浓度升高，差异有统计学意义。实验组组内按时间比较时显示bFGF浓度无统计学意义，而PDGF的浓度随时间变化呈现统计学差异。该结果表明，通过血管再生法进行延迟再植的实验牙根尖周出现新血管和牙体硬组织生成，对于延迟再植的效果有着积极的作用。

牙髓血管再生是近年来出现的新型治疗方法，可以有效缩短治疗时间，促使牙根发育、根尖孔闭合、根管壁增厚。但牙髓血管再生的长期效果、生物学机制以及可能出现的不良影响仍需继续研究，本实验为该项技术的临床应用奠定基础。

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(收稿：2015-09-16)

The effects of bFGF and PDGF expression in pulp revascularization. Department of Stomatology,Central Hospital of Xi’an

(Xi’an 710004 )

Zhang Xin Liu Yanli

Objective： To study the effects of pulp revascularization on the expression of bFGF and PDGF in the root tissue of young permanent dog teeth through delayed tooth replantation .Methods:4 dogs with immature teeth aged approximately 5 months were selected. The experimental group contained 11，13，15，41，43，45 and the teeth in other side as the control group. The replantation was proceeded 24 hours later when pulp revascularization was finished in experimental group and none treatment in control group. Statistical analysis was performed to detect bFGF and PDGF content after 3 and 6 months feed. Results:There were 3 blood clots without formation of, 7 poor MTA filling, 5 alveolar bone absorption of II or III degree and 3 root fracture. The concentration of the bFGF and PDGF in experimental group was increased and was significant different with the control group in 3 and 6 month. There was no significant difference in the experimental group on the concentration of bFGF according to the time comparison, while the concentration of PDGF had significant different. Conclusion:Pulp revascularization is a new treatment for delayed tooth replantation. It’s a long term effect mechanism, biology, human tissue, the mechanism of molecular biology and possible adverse effects still need to study for clinical application in the future.

Tooth/Immature @Pulp revascularization Tooth delayed replantation

*陕西省科学技术研究发展计划项目(2014K11-03-08-04)

牙/解剖学 @牙髓血运重建术 牙再植术

R781.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.004

∆通讯作者：第四军医大学口腔医院口腔急诊与综合临床科