miR-487a增加MCF-7/MX荷瘤鼠对米托蒽醌敏感性机制探讨*

中国医科大学附属第一医院乳腺外科(沈阳 110001)

关 舒 于鑫淼 毛晓韵 魏敏杰△ 金 锋 何 苗

miR-487a增加MCF-7/MX荷瘤鼠对米托蒽醌敏感性机制探讨*

中国医科大学附属第一医院乳腺外科(沈阳 110001)

关 舒 于鑫淼 毛晓韵 魏敏杰△金 锋 何 苗

目的：研究miR-487a调控米托蒽醌(MX)耐药的乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX荷瘤鼠对MX敏感性的作用与机制。方法：通过裸鼠腋窝皮下接种MCF-7/MX细胞构建荷瘤鼠模型；real-time RT-PCR、Western blot方法检测荷瘤鼠瘤体内注射miR-487a agmir后对移植瘤内miR-487a及BCRP表达的影响；并通过对荷瘤鼠尾静脉注射MX后移植瘤体积和瘤重的检测，研究miR-487a对MCF-7/MX荷瘤鼠药物敏感性的影响。结果：在MCF-7/MX细胞荷瘤鼠瘤体内注射miR-487a agmir诱导miR-487a表达增高约7倍；降低了移植瘤内的BCRP的mRNA和蛋白表达约30%；且显著降低了MX处理的MCF-7/MX细胞荷瘤鼠移植瘤的重量，即增加了对MX的敏感性。结论：miR-487a抑制了MCF-7/MX细胞荷瘤鼠的BCRP表达，增加其对米托蒽醌的敏感性。

米托蒽醌(MX)是常见的乳腺癌治疗用药，但化疗过程中出现的耐药问题严重影响了其临床疗效和患者的预后。miRNA是一种大小约21-25bp的单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，为一组不编码蛋白质的短序列RNA。miRNA通过与特定靶基因的3’端非编码区(3’UTR)特异结合，调节靶基因的蛋白翻译过程调控基因的表达[1]。近些年，miRNA调节肿瘤细胞耐药的作用引起广大学者的关注[2,3]。本实验对裸鼠进行米托蒽醌(MX)耐药的乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX皮下注射，构建了在体移植瘤模型，检测荷瘤鼠瘤体内注射miR-487a agmir后对移植瘤内miR-487a及BCRP表达的影响；并以MX处理上述模型后，观察小鼠对MX的敏感性改变，探讨荷瘤鼠水平时miRNA-487a对BCRP介导的乳腺癌耐药作用的调控及可能机制。

材料和方法

1 细胞培养 米托蒽醌(MX)耐药的MCF-7人乳腺癌细胞(MCF-7/MX)，在含10%的FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM(Invitrogen, USA)培养基，5% CO2、37℃细胞培养箱中培养。MCF-7/MX细胞系培养时需定时加入MX诱导耐药。

2 裸鼠移植瘤模型建立 BALB/c无胸腺雌性裸鼠(4～6周龄)，饲养在中国医科大学实验动物中心SPF级动物室。将MCF-7/MX细胞(8×106)悬浮于PBS中，200 μl接种到裸鼠的腋窝皮下。当肿瘤平均体积大小达到约100～200mm3时，将移植裸小鼠随机分成2组(每组n=6)：阴性对照组(NC)agmir组和miR-487a agmir，两组小鼠分别瘤体内注射1nM的NC agmir和miR-487a agmir(RiboBio, China)，每周两次，共5次注射。

在考察miR-487a对MX的抗肿瘤作用影响的实验中，将荷瘤鼠随机分成3组(每组n=6)：NC agmir，NC agmir + MX和miR-487a agmir + MX治疗组，3组小鼠分别瘤体内注射1 nM 的NC agmir和miR-487a agmir(RiboBio, China)，每周两次，共5次注射。NC agmir+ MX和miR-487a agmir+ MX治疗组小鼠，同时给予每周两次尾静脉注射MX(1.5 mg/kg)，共5次注射。

3 qRT-PCR分析 qRT-PCR方法检测BCRP的mRNA表达。RNA提取试剂盒提取移植瘤总RNA，逆转录PCR体系：100 ng RNA、50 μM Oligo dT、dNTPs各0.125 mM、60 U/μl M-MLV、1 U/μl RNA酶抑制剂、5×RT 缓冲液；条件：42℃ 30min、85℃ 5min、4℃恒温。PCR体系：1 μl cDNA、6.25 μl 2×SYBR、0.25 μl ROX、1 μl上下游引物(10 μM)、3 μl ddH2O；PCR条件：95℃ 预变性2min，95℃30s、60℃45s、72℃30s8个循环，95℃30s、56℃45s、72℃30s35个循环，β-actin用作内参。mRNA的变化情况用2-ΔΔCT计算和表示。实验至少重复3次取平均值。

4 Western-Blot 分析 将裸鼠肿瘤组织经超声匀浆，提取蛋白。蛋白定量后，与上样缓冲液混合(1∶5)，煮沸变性。10%SDS-PAGE电泳后，湿转过夜。5%脱脂奶粉室温封闭1h。一抗BCRP(1∶1000, Abcam)，4℃过夜。二抗(1∶3000，Santa Cruz Biotechnology)，室温1 h孵育。ECL化学发光。

结 果

1 miR-487a agmir诱导MCF-7/MX荷瘤鼠移植瘤内miR-487a高表达 我们在4～6周雌性裸鼠的肩胛处皮下注射MCF-7/MX细胞悬液(8×106)制备移植瘤模型，当移植瘤体积达到约100～200mm3时，瘤内注射miR-487a agmir或NC agmir。4周后，应用real-time RT-PCR检测移植瘤内miR-487a的表达情况。结果发现：miR-487a agmir转染组miR-487a的表达约为NC组的7倍，表明瘤体内多点注射转染miR-487a agmir可诱导荷瘤鼠移植瘤组织miR-487a持续高表达(P<0.05)。

2 miR-487a agmir抑制MCF-7/MX荷瘤鼠移植瘤的BCRP表达 我们通过real-time RT-PCR和Western blot分别检测了移植瘤内BCRP的mRNA和蛋白表达情况，发现：与NC组相比，miR-487a agmir转染组中BCRP mRNA表达水平降低约30%(P<0.05)；miR-487a agmir转染组中BCRP 的蛋白表达也受到明显的抑制。表明miR-487a可抑制MCF-7/MX荷瘤鼠的乳腺癌耐药蛋白BCRP的表达。

3 miR-487a agmir增强MCF-7/MX细胞荷瘤鼠对MX的敏感性 上述实验证实了miR-487a agmir能够抑制MCF-7/MX细胞荷瘤鼠移植瘤内BCRP的表达，为了考察其是否因此而增强荷瘤鼠对MX的敏感性，我们检测了miR-487a agmir瘤体内注射的MCF-7/MX细胞荷瘤鼠，给予尾静脉注射MX后移植瘤的生长情况。荷瘤第31天实验结束，处死小鼠，取瘤组织称重发现：与miR-NC+MX组相比，miR-487a agmir+MX组的瘤重减轻更明显。表明miR-487a agmir增强了MX对荷瘤鼠重量的抑制作用。这些结果证实了miR-487a agmir增强了MCF-7/MX细胞荷瘤鼠对MX的敏感性。

讨 论

乳腺癌耐药蛋白(BCRP/ABCG2)是三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(Adenosine triphosphate binding cassette transporters, ABC)家族中的重要成员之一，由ABCG2基因编码[4]，可特异性将米托蒽醌等转运底物从细胞内转运到细胞外，导致细胞内药物浓度降低，最终引起肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降，即产生多药耐药(MDR)[5]。miRNA作为非编码RNA之一，主要通过与目标mRNA分子的3’端非编码区(3’UTR)特异结合，然后在转录后水平抑制靶基因的翻译和表达。若其靶基因为原癌基因，调控其表达的miRNA则发挥抑癌基因的活性；相反，如靶基因为抑癌基因，则调控其表达的miRNA作为癌基因发挥作用。因此，miRNA对于肿瘤的发生发展起着非常重要的调控作用，约60%的基因表达由miRNA调控。

有细胞实验证实了某些miRNA可调节BCRP的表达，如Wang等[6]在胰腺癌中发现hsa-miR-520h下调BCRP的表达，抑制肿瘤的转移，侵袭和干性。但是在动物实验中相关研究报道不多。于是，本实验参照Jin等[7]的方法，将MCF-7/MX细胞进行裸鼠皮下接种7d移植瘤长到约100～200mm3后，将1 nmol的miR-487a agmir进行裸鼠移植瘤内多点注射，同时给予尾静脉注射MX(1.5 mg/kg)处理，发现miR-487a agmir注射后可使瘤组织内miR-487a表达增加，提示可通过瘤体内多点注射的方式使miR-487a在体内持续高表达。且我们发现瘤体内注射miR-487a agmir后可使瘤组织BCRP表达下调，移植瘤的重量下降，即增加MX抑制肿瘤生长的作用。有力的证明了miR-487a在调控乳腺癌细胞BCRP表达及药物敏感性方面具有重要作用，同时为荷瘤鼠在体转染miRNAs进行靶向调控乳腺癌BCRP表达与功能的研究，提供了切实可行的实验方法。

[1] Taylor MA, Schiemann WP. Therapeutic opportunities for targeting microRNAs in cancer[J]. Mol Cell Ther,2014, 2(30):1-13.

[2] Toden S, Okugawa Y, Jascur T,etal. Curcumin mediates chemosensitization to 5-fluorouracil through miRNA-induced suppression of epithelial-to-mesenchymal transition in chemoresistant colorectal cancer[J]. Carcinogenesis, 2015, 36(3):355-367.

[3] Van Roosbroeck K, Pollet J, Calin G. miRNAs and long noncoding RNAs as biomarkers in human diseases. Expert Rev[J]. Mol Diagn, 2013, 13(2): 183-204.

[4] Karibe T, Hagihara-Nakagomi R, Abe K,etal. Evaluation of the Usefulness of Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) Knockout Mice andBCRP Inhibitor-Treated Monkeys to Estimate the Clinical Impact of BCRP Modulation on the Pharmacokinetics of BCRP Substrates[J]. Pharm Res,2015, 32(5):1634-1647.

[5] Jani M, Ambrus C, Magnan R,etal. Structure and function of BCRP, a broad specificity transporter of xenobiotics and endobiotics[J]. Arch Toxicol,2014, 88(6):1205-1248.

[6] Wang F, Xue X, Wei J,etal. hsa-miR-520h downregulates ABCG2 in pancreatic cancer cells to inhibit migration, invasion, and side populations[J]. Br J Cancer,2010, 103(4):567-574.

[7] Hou J, Lin L, Zhou W,etal. Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Cell, 2011, 19(2):232-243.

(收稿：2015-07-19)

The study of mechanisms of miR-487a on increasing the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to mitoxantrone (MX) Department of Breast Surgery, the First Hospital of China Medical University

(Shenyang 110001)

Guan Shu Yu Xinmiao Mao Xiaoyun et al

Objective: To explore the action and mechanisms of miR-487a on the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX. Methods: The xenograft mice were constructed by inoculating subcutaneously MCF-7/MX cells into the flank of nude mice. The expression of miR-487a and breast cancer resistance protein (BCRP) in xenograft tumors induced by MCF-7/MX cells after injecting miR-487a agmir were examined by real-time RT-PCR and Western blot analysis. The sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX was analyzed by observing the changes of the tumor weight. Results: The intratumoral injections of miR-487a agmir induced the increases of miR-487a by 7 fold, decreased the mRNA and protein expression of BCRP by 30%, and significantly reduced the tumor weight of the xenograft mice. Concluslon: miR-487a can inhibit the expression of BCRP and increase the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX.

Breast neoplasms @microRNAs Animals,laboratory Rats Nude

*国家自然科学基金(81102472, 81341063, 81201886)

乳腺肿瘤 @microRNAs 动物，实验 大鼠，裸

R655.8

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.002

沈阳市科技计划项目(F12-148-9-00)

△通讯作者:中国医科大学药学院药理教研室