芍药苷预处理通过干预NF-κB信号通路对在体大鼠MIRI发挥保护作用*

西安市第九医院(西安 710054)

高宇勤 郝霁萍∆ 刘美林 赵国平▲

芍药苷预处理通过干预NF-κB信号通路对在体大鼠MIRI发挥保护作用*

西安市第九医院(西安 710054)

高宇勤 郝霁萍∆刘美林 赵国平▲

目的：探究芍药苷预处理通过干预NF-κB信号通路对大鼠在体心肌缺血再灌注损伤的干预作用。方法：结扎SD大鼠心脏冠状动脉(LDA)建立在体MIRI模型，利用0.5 %Evan’s 蓝灌注心肌及1 %TTC 磷酸缓冲液孵育心肌以观察心肌坏死；Western blot探究芍药苷预处理对NF-κB信号通路的影响。结果：芍药苷药物预处理组(心梗面积0.13±0.04)与缺血再灌注组(0.360.06)比较，心梗面积明显减小(P<0.01)；芍药苷预处理抑制NF-κB蛋白的表达，能降低I-κB磷酸化，升高非磷酸化I-κB蛋白表达。结论：芍药苷预处理降低大鼠在体MIRI模型的梗死面积、减轻炎症表达，可能通过抑制NF-κB蛋白的表达，降低I-κB磷酸化，升高非磷酸化I-κB蛋白表达而实现。

目前研究认为NF-κB 活化是心肌缺血再灌注早期众多细胞因子表达的始动因素,NF-κB转录后促进细胞因子如ICAM-1、TNFα等表达，进而造成组织的炎症损伤[1]。抑制NF-κB激活，有助于减轻心肌缺血再灌注损伤，抑制急性炎症反应。所以研究药物预处理干预此环节以求减轻心肌的MIRI是个研究热点。芍药苷对脑缺血损伤具有保护作用[2]。但是对于MIRI的研究较少，是否干预NF-κB信号通路，目前没有相关研究。本实验采用在体SD大鼠冠状动脉前降支(LAD)结扎术建立模型来观察芍药苷预处理是否通过干预NF-κB信号通路而发挥心肌保护作用。

材料和方法

1 试剂与仪器 芍药苷购于南京泽朗医药公司(批号:ZL20090409SYG), NF-κB抗体，pI-κB(ser32/36)抗体，I-κB抗体购自SANTA CRUZ公司; 其余皆为国产试剂。

2 动物模型 SPF 级雄性SD(30只)大鼠，体重280～400g，由广东省医学实验动物中心提供。许可证号：SCXK(粤)2008-0002，2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，行气管插管，接呼吸机，呼吸频率60次/min、通气量20ml/kg。纵形剪开第三肋骨，钝性分离胸腔，显露心脏，确定缝扎位置(肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2mm)。用0号线，叠一个0.8～1mm的凹槽硅胶管，结扎LAD，缺血30min后，复灌2h。模型复制的可靠性以ECGⅡ导联ST段抬高为心肌缺血存在，以ST段回落1/2为再灌注成功。本实验建模总共有4只SD大鼠因为麻醉和手术原因死亡，死亡率13%。

3 分组及给药方案 30只雄性SD大鼠被随机分为3组,每组10只，3组分别为：假手术组(此组只开胸，但不结扎LAD)、缺血再灌注组、药物预处理组。

药物预处理组给予芍药苷100mg/kg灌胃，1d/1次，连续4d，最后一次于手术前30min给予。其他两组给予等量生理盐水。

4 心肌梗死面积测定 原位结扎左冠状动脉主干，经主动脉逆行灌注 0.5 %Evan’s 蓝 2～3 ml , 立即取心脏，冲洗，将左室与其他心肌组织分离，快速置于液氮中，取出冷冻心脏，延左室长轴方向连续环切，每片2～3mm，正常心肌为蓝色，缺血心肌为粉色，将无蓝染心肌置入1 %TTC中 37 ℃孵育20min ,坏死区呈灰白色 ,非坏死区呈深红色 ,分离两部分 ,滤纸吸干,称重。梗死面积以坏死区重量与坏死区与非坏死区重量之和之比表示。

5 心肌组织HE染色 再灌注结束后，剪下心脏，洗净，分离左心室前壁缺血区，切取3～5mm3组织，10%中性甲醛固定12h，脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、染色及中性树胶封片，镜下观察。

6 蛋白印迹(Western blot)检测 检测NF-κB、I-κB蛋白，上液蛋白总量80μg，检测pI-κB蛋白,上液蛋白量为120μg。转膜条件：350 mA恒流湿转45min。一抗孵育条件：anti-NF-κB(1∶1000)，anti-I-κB(1∶1000)，Anti-GAPDH(1∶2000), anti-pI-κB(1∶500)4 ℃ 孵育过夜，二抗(1∶5000)。用ECL 发光液，涂膜，盖片，曝光，Quantity one软件分析 Western blot 条带的灰度值。

结 果

1 芍药苷预处理对心肌梗死面积 本实验利用0.5 %Evan’s 蓝灌注心肌及1 %TTC 磷酸缓冲液孵育心肌来观察心肌坏死。芍药苷预处理组与缺血再灌注组比较，心梗面积明显减小(P<0.01)。

2 芍药苷预处理对心肌组织病理的影响 HE染色观察芍药苷预处理对在体大鼠MIRI心肌病理形态的影响(见附图)。缺血再灌注组大鼠心肌纤维排列紊乱，心肌间质水肿，充血、出血，心肌横纹不清或消失，细胞核肿胀甚至销蚀、脱失，而芍药苷预处理组的大鼠心肌损伤较缺血再灌注组心肌纤维结构较轻，心肌间质轻度水肿，部分核染色呈深染改变。组织病理学提示芍药苷预处理可以减轻缺血再灌注损伤。

附图 芍药苷预处理对大鼠心肌组织病理的影响

3 芍药苷预处理对缺血再灌注损伤模型大鼠心肌NF-κB信号通路的影响 蛋白印迹(Western blot)观察芍药苷预处理对大鼠心肌NF-κB信号通路的影响。缺血再灌注组中，胞浆及胞核内的NF-κB蛋白含量明显高，而且磷酸化的pI-κB蛋白也明显高，而非磷酸化I-κB明显低，而芍药苷预处理组的上述蛋白表达明显相反，差别达到统计学意义，分别为(P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.01)。

讨 论

NF-κB是一种具有基因转录多向调控作用的转录因子，以失活状态存在于胞质中。当各种配体与受体结合后使I-κB磷酸化及pI-κB升高，随后NF-κB活化后进入细胞核，在核内与靶基因的特异序列结合并动转录，促进细胞因子如ICAM-1、TNFα等的生成，造成内皮、心肌细胞的损伤以及炎症损伤[3]。通过下调心肌组织NF-κB和pI-κB，升高I-κB的表达，可以减少心肌炎症反应及组织损伤。研究发现芍药苷[4]可降低BAX及Caspase-3的表达，上调BCL-2的表达，减少心肌细胞凋亡及心肌梗死面积，但是对于NF-κB信号通路的影响，缺乏文献报道，本实验利用0.5 %Evan’s 蓝灌注及1 %TTC 孵育心肌，发现芍药苷能减少大鼠MIRI模型的心梗面积，同文献报道相符[4]；组织病理学观察也应证了芍药苷预处理可以减轻心肌缺血再灌注损伤程度。同时实验发现，芍药苷预处理能抑制胞浆内的NF-κB蛋白的表达，并减少细胞核内NF-κB蛋白含量，同时芍药苷预处理增加非磷酸化I-κB蛋白表达，减少磷酸化pI-κB蛋白表达，证明芍药苷预处理通过抑制NF-κB信号通路而发挥心肌保护作用。

[1] Lu M, Tang F, Zhang J,etal.Astragaloside IV attenuates injury caused by myocardial ischemia/reperfusion in rats via regulation of toll-like receptor 4/nuclear factor-κB signaling pathway[J].Phytother Res,2015,29(4):599-606.

[2] Xiaofei Li, Zhibin Wen, Xiaofan He,etal. Effects of Cinnamic Acidon Expression of Tissue Factor Induced by TNFα in Endothelial Cells and its Mechanisms[J]. J Chin Med Assoc,2006,69(5):207-212.

[3] Yuan X, Niu HT, Wang PL,etal.Cardioprotective Effect of Licochalcone D against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Langendorff-Perfused Rat Hearts[J].PLoS One. 2015,10(6):e0128375.

[4] Nizamutdinova IT, Jin YC,Kim JS, Yean MH,etal. Paeonol and paeoniflorin, the main active principles of Paeonia albiflora, protect the heart from myocardial ischemia/reperfusion injury inrats[J]. Planta Med,2008,74(1):576-584.

(收稿：2015-07-15)

*国家自然科学基金(81173189)

心肌缺血/并发症 再灌注损伤 NF-κB @芍药苷

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.005

西安市卫生局科技项目(2013022)

西安科技项目(SF1416)

▲暨南大学医学院

∆通讯作者