HIF-2α在宫颈癌组织中的表达及意义

陕西省肿瘤医院妇瘤科(西安710061)

袁 渊 常晓斌△ 姚安梅 周 敏

HIF-2α在宫颈癌组织中的表达及意义

陕西省肿瘤医院妇瘤科(西安710061)

袁 渊 常晓斌△姚安梅 周 敏

目的：探讨低氧诱导因子2α(HIF-2α)在宫颈癌组织中的表达以及在宫颈癌发生发展中的作用。方法：采用免疫组化法检测HIF-2α在正常宫颈及宫颈癌组织中的表达，并将HIF-2α表达与宫颈癌的临床病理特征进行相关分析；采用siRNA技术干扰HIF-2α在宫颈癌细胞HeLa、SiHa的表达，Western blot技术检测HIF-2α蛋白在宫颈癌细胞的表达； MTT试验检测HeLa、SiHa细胞增殖情况。结果：HIF-2α在宫颈癌组织的表达明显高于正常宫颈组织，经χ2检验，有统计学意义，并且HIF-2α表达与宫颈癌的淋巴转移呈正相关，但与宫颈癌患者的年龄、病理分级以及临床分期无显著性相关。低氧可诱导HIF-2α表达增加，并促进HeLa、SiHa细胞增殖，而干扰HIF-2α表达后，则抑制HeLa、SiHa细胞增殖，经t检验，具有统计学意义。结论：HIF-2α在宫颈癌中的表达升高，其对宫颈癌的发生发展起促进作用。

目前宫颈癌的发病率在全球妇女恶性肿瘤中位居第三，也是导致女性死亡的第四大恶性肿瘤[1]。虽然在宫颈癌的临床诊治方面取得了一些进展，但关于宫颈癌发病的具体机制尚未阐明。HIF-2α(Hypoxia-inducible factor-2α)是一种低氧转录反应的调节子，其主要表达在血管内皮细胞中，与胚胎的形成及发育密切相关[2]。近年来，有研究报道HIF-2α在许多类型肿瘤中的表达上调，例如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等[3]，并有可能是肿瘤干细胞的一种标志[4]。为了阐明HIF-2α蛋白在宫颈癌中的表达及作用，本研究应用免疫组化技术检测HIF-2α蛋白在宫颈癌中的表达情况，并通过siRNA干扰及Western blot等技术深入探讨HIF-2α蛋白在宫颈癌发生、发展中的作用。

材料和方法

1 材 料 90例临床标本来自于陕西省肿瘤医院2011年12月至2013年12月妇瘤科住院患者，其中宫颈癌组织63例，患者术前均未进行放疗及化疗，正常宫颈组织27例，取自于同时期住院的子宫肌瘤子宫全切患者，所取组织立即置于10%中性福尔马林固定。所有标本均经查阅病例资料并由本院病理医师复阅HE切片证实。

2 主要试剂与仪器 siRNA片段由北京英俊公司合成；HeLa、SiHa细胞株购自ATCC(美国组织培养保藏中心)；HIF-2α蛋白抗体(Abcam, 美国)；β-actin单抗(Santa Cruz，美国)；脂质体Lipofectamine2000TM(Invitrogen，美国)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma，美国)；DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；CoCl2(Sigma, 美国)；CO2培养箱(Thermo，美国)；超净工作台(苏州净化设备厂)；酶标仪(Bio-Rad，美国)；显微镜(Olympus，日本)。

3 实验方法

3.1 细胞培养： He La、SiHa细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，置5% CO2培养箱中，37oC孵育。低氧环境采用含300 μmol/L氯化钴的培养基模拟。

3.2 细胞转染： 取指数生长的肿瘤细胞，将HIF-2α的siRNA采用脂质体法转染至HeLa及SiHa细胞，操作步骤按照LipofectamineTM2000说明书进行。

3.3 免疫组化： 石蜡包埋后，5μm切片，常规免疫组织化学染色，简述如下：二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，抗原热修复2 min，3%过氧化氢溶液灭活10 min，滴加HIF-2α一抗(1：100)，4oC 孵育过夜。次日，室温下复温30 min，PBS洗涤5 min×3次，加二抗，室温孵育1 h，PBS洗涤5 min×3次，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

阳性结果判定：按照阳性细胞百分比分为4个等级；1级为 < 25%，2级为25%～50%，3级为50～75%，4级为≥ 75%。按染色强度分为4个等级：0级没有染色，1级浅棕色，2级棕色,3级暗褐色。染色评分公式：免疫组化评分=百分比评分×染色强度评分。评分≤3为阴性,>3为阳性。

3.4 Western blot 检测： 参照Bolos V等人描述的方法进行。收集指数生长期的细胞，用RIPA 裂解液(RIPA lysis buffer)冰上裂解细胞30 min，12000 rpm离心15 min，提取细胞总蛋白。BCA法测蛋白浓度后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白，湿法转至PVDF膜，5%脱脂奶封闭1 h，滴加一抗(抗HIF-2α 1:500，抗β-actin 1∶1000)，于4oC孵育过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜后，用增强化学发光系统(ECL)检测，暗室曝光，显影，定影，扫描。

3.5 细胞增殖测定： 将对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板(1×103/孔)，分别在常氧及低氧环境下培养，培养24、48、72、96 h后，每孔加入MTT溶液20 μl(5 g/L, pH=7.4)，继续孵育4 h，弃上层培养液，每空加入100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，终止反应，震荡10min，用酶标仪测定其光吸收值，检测波长为490nm。

结 果

1 HIF-2α在正常宫颈及宫颈癌组织的表达 采用免疫组化染色法对63例宫颈癌组织及27例正常宫颈组织进行了检测，如图1所示，HIF-2α蛋白主要表达在宫颈癌组织的细胞核及细胞浆中，而在正常宫颈组织则表达较少。将染色结果定量分析发现，HIF-2α蛋白在宫颈癌组织的阳性表达率为77.5%，而在正常宫颈组织的阳性表达率仅为16.7%。二者相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图 2。结果表明HIF-2α蛋白在宫颈癌组织中的表达上调，其可能与宫颈癌的发生、发展有关。

图1 HIF-2α蛋白在正常宫颈及宫颈癌组织的表达(A：HIF-2α在正常宫颈组织的表达；B：HIF-2α在宫颈癌组织的表达；C：阴性对照;D：阴性对照。×400)

图2 HIF-2α蛋白在正常宫颈及宫颈癌组织中的阳性表达率(NC：正常宫颈；SCC ：鳞状宫颈癌。与正常宫颈相比，*P<0.05)

2 HIF-2α表达与宫颈癌患者病理特征的相关分析 HIF-2α蛋白表达与患者的年龄、宫颈癌病理分级以及临床分期均无显著性关联(P>0.05)，而HIF-2α蛋白的表达与宫颈癌淋巴转移呈明显正相关，经χ2检验，具有统计学意义(P<0.05)，见附表。

附表 宫颈癌中HIF-2α表达与临床病理特征相关性分析

注：与HIF-2α(-)相比较，*P>0.05, #P<0.05

3 低氧环境对宫颈癌细胞增殖的影响 分别在常氧和低氧环境下培养宫颈癌细胞系HeLa和SiHa细胞，用MTT法分别在24、48、72和96 h检测细胞的光密度，如图3所示，结果表明HeLa和SiHa细胞的增殖速度，低氧组均明显快于常氧组，尤其在72和96 h时，经t检验，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图3 低氧环境对宫颈癌细胞增殖的影响(A：低氧对HeLa细胞增殖的影响；B：低氧对SiHa细胞增殖的影响。与常氧组相比较，*P<0.05，**P<0.01)

图4 低氧环境对HeLa、SiHa细胞中HIF-2α蛋白表达的影响(A：Western blot 检测HeLa细胞中HIF-2α蛋白表达；B：HIF-2α蛋白表达的定量分析；C：Western blot 检测SiHa细胞中HIF-2α蛋白表达；D：HIF-2α蛋白表达定量分析。与常氧组相比较，*P<0.05，**P<0.01)

4 低氧环境对宫颈癌细胞中HIF-2α蛋白表达的影响 通过Western blot方法分别检测低氧组和常氧组HeLa、SiHa细胞中HIF-2α蛋白的表达。结果显示，在HeLa细胞中HIF-2α在低氧组的表达明显高于常氧组，见图4A、B。定量分析后，将HIF-2α蛋白在两组的表达相比较，具有显著性差异(P<0.01)。与HeLa细胞中的结果相似，HIF-2α蛋白在SiHa细胞中的表达，其低氧组也明显高于常氧组，经t检验，亦具有统计学意义(P<0.01)，见图4。

5 干扰HIF-2α蛋白表达对宫颈癌细胞增殖的影响 通过采用siRNA干扰技术分别沉默HIF-2α蛋白在宫颈癌细胞系HeLa、SiHa细胞中的表达，如图5A、B。将HeLa和SiHa细胞分别分为对照(siCon)和干扰(siHIF-2α)两组，然后分别在常氧和低氧环境下培养，即为常氧对照组(常氧siCon)，低氧对照组(低氧siCon)和低氧干扰组(低氧siHIF-2α)。低氧环境采用含300 μmol/L氯化钴的培养基模拟，常氧环境即普通培养基。如图5C、D所示，在培养24、48、72和96 h后，通过MTT法分别检测各组细胞的光密度。结果发现，在72和96 h处，HeLa和SiHa细胞的光密度，在未干扰HIF-2α(siCon)的情况下，其低氧组与常氧组相比，均出现明显升高，经t检验，具有统计学意义(P<0.01)，在低氧环境下培养的HeLa和SiHa细胞，其低氧干扰组(低氧siHIF-2α)的光密度与低氧对照组(低氧siCon)相比，均出现了显著降低，经t检验，亦具有统计学意义(P<0.01)。

图5 干扰HIF-2α 蛋白表达对HeLa、SiHa细胞增殖的影响(A：Western blot检测HeLa细胞中HIF-2α 表达；B：Western blot检测SiHa细胞中HIF-2α 表达；C：MTT法检测HeLa细胞增殖；D：MTT法检测SiHa细胞增殖。与低氧对照组相比较，*P<0.05，**P<0.01)

讨 论

近年来，宫颈癌在年轻妇女中的发病率和病死率均有升高的趋势[5]，因此，深入研究宫颈癌的发病机制具有十分重要意义。低氧是实体瘤发展过程中的一个重要因素，它与肿瘤转移以及血管发生过程中的许多标志性因子有关，低氧诱导因子则是应对低氧这一反应的关键因子。HIF-2α是低氧转录因子家族的一个重要成员，它控制着许多在胚胎发育及生理过程中关键基因的表达。已有研究表明，HIF-2α在肿瘤进展中起重要作用，但HIF-2α在宫颈癌中的作用目前尚无报道。

本研究通过对27例正常宫颈及63例宫颈癌组织进行免疫组化染色发现， HIF-2α蛋白在宫颈癌组织的阳性表达率明显高于正常宫颈组织，差异具有统计意义。这说明HIF-2α蛋白在宫颈癌组织中的表达是升高的，提示HIF-2α蛋白可能与宫颈癌的发生、发展有关。通过分析不同HIF-2α蛋白表达水平与宫颈癌临床病理特征之间的关系发现，HIF-2α蛋白的表达与宫颈癌的淋巴转移呈正相关，而与宫颈癌患者的年龄、病理分级及临床分期无显著性相关，这表明HIF-2α蛋白可能涉及宫颈癌的转移，已有研究报道表明，HIF-2α蛋白在肿瘤中的表达升高与肿瘤的血管生成及不良预后有关[6]，本研究结果也从另一方面证实HIF-2α蛋白在宫颈癌进展中具有重要作用。

低氧环境是实体瘤细胞经常面临的一种环境，恶性肿瘤细胞具有适应并在低氧环境下生长的能力[4]。本研究发现低氧能促进宫颈癌细胞系HeLa、SiHa细胞的增殖，由于恶性肿瘤细胞对低氧的适应以及应答都与低氧诱导因子家族有关。通过Western blot检测发现，在低氧环境下，HeLa、SiHa细胞中HIF-2α蛋白表达水平与常氧环境相比，差异具有统计学意义。这表明低氧促进宫颈癌细胞的增殖可能与细胞中HIF-2α蛋白表达水平升高有关。

为进一步检验HIF-2α蛋白表达对宫颈癌细胞增殖的影响，通过siRNA技术干扰HIF-2α蛋白在宫颈癌细胞系HeLa、SiHa细胞中的表达，然后分别进行细胞增殖实验。结果发现，低氧对照组中HeLa和SiHa细胞的增殖速度明显高于常氧对照组，进一步证实了低氧能促进宫颈癌细胞的增殖。然而，低氧干扰组中HeLa和SiHa细胞的增殖速度与低氧对照组相比，却明显降低，表明干扰HIF-2α蛋白表达能导致宫颈癌细胞增殖的显著抑制，这表明HIF-2α蛋白在促进宫颈癌细胞增殖中具有重要作用。有研究表明，在低氧环境中，HIF-2α蛋白表达增加，通过与靶基因的低氧反应元件(HREs)结合，诱导靶基因的转录激活，这些靶蛋白往往涉及低氧耐受或血管生成。在宫颈癌组织中，局部低氧环境可能诱导HIF-2α蛋白表达增加，HIF-2α进一步通过诱导一系列相关蛋白的表达，促进宫颈癌的发展。这也与一些研究表明HIF-2α可通过诱导VEGF表达，促进肿瘤的进展相一致[7]。

综上所述，本研究通过检测HIF-2α蛋白在正常宫颈及宫颈癌中的表达，结果表明HIF-2α蛋白在宫颈癌组织中的表达升高，并证实HIF-2α蛋白能促进宫颈癌细胞的增殖，这说明HIF-2α蛋白可能在宫颈癌的发生、发展中起着重要作用，这将为宫颈癌的治疗提供新的生物靶点。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM,etal. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

[2] Aouadi M. HIF-2α blows out the flames of adipose tissue macrophages to keep obesity in a safe zone [J]. Diabetes, 2014, 63(10):3169-3171.

[3] Rawuszko-Wieczorek AA, Horbacka K, Krokowicz P,etal. Prognostic potential of DNA methylation and transcript levels of HIF1A and EPAS1 in colorectal cancer [J]. Mol Cancer Res, 2014, 12(8):1112-1127.

[4] Li Z, Bao S, Wu Q,etal. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells [J]. Cancer Cell, 2009, 15(6): 501-513.

[5] Cai HB, Liu XM, Huang Y,etal.Trends in cervical cancer in young women in Hubei, China [J]. Int J Gynecol Cancer, 2010, 20 (7): 1240-1243.

[6] Cuvillier O, Ader I, Bouquerel P,etal. Hypoxia, therapeutic resistance, and sphingosine 1-phosphate [J]. Adv Cancer Res, 2013, 117:117-141.

[7] Zhao D, Zhai B, He C,etal. Upregulation of HIF-2α induced by sorafenib contributes to the resistance by activating the TGF-α/EGFR pathway in hepatocellular carcinoma cells [J]. Cell Signal, 2014, 26(5):1030-1039.

(收稿：2015-02-27)

The significance of HIF-2α expression in cervical cancer

Department of Gynecological Oncology, Shaanxi Provincial Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Yuan Yuan Chang Xiaobin Yao Anmei et al

Objective: To explore the expression of HIF-2α in cervical cancer and its role in the cervical cancer initiation and progression. Methods: The expression of HIF-2α in cervical cancer and normal cervix were measured using immunohistochemistry, and the correlation between HIF-2α and clinicopathological parameter of cervical cancer was analyzed. HIF-2α expression in HeLa and SiHa cells were measured by western blot assay and HIF-2α in HeLa and SiHa cells were knocked down by siRNA technology. Subsequently, cell proliferation assay were performed by MTT. Results: The expression of HIF-2α in cervical cancer was significantly increased compared with the normal cervix , and HIF-2α expression was positively correlated with lymphatic metastasis of cervical cancer, but the significant correlation between HIF-2α expression and age, pathological grade, clinical stage of patients were not observed. Hypoxia induced the expression of HIF-2α and promoted cell proliferation of HeLa and SiHa cells, but the knockdown of HIF-2α resulted in a significant inhibition of cell proliferation.Conclusion: HIF-2α expression in cervical cancer is significant increased, and HIF-2α promoted the initiation and progression of cervical caner.

Uterine cervical neoplasms/pothology Hypoxia-inducible factor 2,alpha Gene expression

子宫颈肿瘤/病理学 缺氧诱导因子2，α亚单位 基因表达

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.008

△陕西省肿瘤医院放疗科