吴茱萸碱对大鼠下丘脑弓状核NPY蛋白表达的影响*

陕西中医学院免疫及检验学教研室(咸阳712046)

施京红 王 萍 胥 冰 张丽君 丁 辉△

·论著·基础研究·

吴茱萸碱对大鼠下丘脑弓状核NPY蛋白表达的影响*

陕西中医学院免疫及检验学教研室(咸阳712046)

施京红 王 萍 胥 冰 张丽君 丁 辉△

目的：研究吴茱萸碱(Evo)对大鼠下丘脑弓状核神经肽Y(NPY)蛋白表达水平的影响。方法：选用雄性5周龄Sprague-Dawly大鼠36只，分为对照组、Evo 4mg/kg组、40 mg/kg组。Evo灌胃25d后取材；采用免疫组织化学和蛋白免疫印迹的方法，观察Evo对下丘脑弓状核中NPY免疫阳性产物的表达和NPY蛋白水平的影响。结果：吴茱萸碱40 mg/kg干预后，下丘脑弓状核NPY-IR阳性细胞数显著减少，同时NPY蛋白表达水平显著降低。结论：Evo可显著降低大鼠下丘脑弓状核促食欲肽NPY蛋白水平，提示下丘脑可能是Evo调节摄食行为的重要中枢。

吴茱萸碱(Evodiamine，Evo)是从芸香科植物吴茱萸的干燥近成熟果实中提取的一种主要生物碱成分，具有多种药理学效应，如降低体重、调节体温、抑制肿瘤、镇痛及对心血管和内分泌系统的作用[1-4]。下丘脑及其回路在调制与摄食有关的内环境稳态信号中起着重要作用，是调节摄食和能量代谢的主要中枢。弓状核(The arcuate nucleus，ARC)是下丘脑中调控摄食与体重的重要核团，包含促进摄食反应和诱导厌食反应的神经元功能区。NPY释放的阶段性升高和降低与食欲的启动与终止有关。我们前期研究表明，Evo能降低下丘脑促食欲肽NPY mRNA的表达，但是，Evo是否影响下丘脑ARC中NPY蛋白水平的表达尚不清楚。我们推测下丘脑可能是Evo发挥降低体重作用的主要中枢位点。本研究采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry)和蛋白免疫印迹(Western Blotting)的方法，观察Evo对下丘脑弓状核中NPY免疫阳性产物的表达和NPY蛋白水平的影响。

材料与方法

1 试 剂 Evo购自陕西汇生医药科技有限公司，纯度99.24%，用双蒸水配制成混悬液。①免疫组化实验试剂：10%小牛血清，武汉博士德生物公司；兔抗大鼠NPY多克隆抗体(bs-0071R)，北京博奥森生物技术有限公司；生物素标记的羊抗兔IgG二抗(HRP)，武汉博士德生物技术公司；②Western Blotting实验试剂：兔抗大鼠NPY多克隆抗体，Chemicon，AB9608，USA；小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体，武汉博士德生物技术公司；山羊抗兔IgG(H&L)二抗(HRP)，武汉博士德生物技术公司；山羊抗小鼠IgG(H&L)二抗(HRP)，武汉博士德生物技术公司。

2 实验方法

2. 1 动物及实验操作：选用雄性5周龄Sprague-Dawly大鼠36只，初始体重60～80g。动物房温度20～22°C，光暗周期为12∶12 h(8：00-20：00)，自由饮食。大鼠被随机分为三组：每组12只。适应实验室条件及实验操作1周后，于上午10：00灌胃。大、小剂量组分别以Evo 40 mg/kg、4 mg/kg剂量灌胃，对照组灌以双蒸水。按1 ml/100g溶液体积根据大鼠体重灌胃，速度为1 ml/5 s，1次/d，共灌胃25 d。动物处死取材在上午10:00-12:00进行。大鼠进行完前述实验后，在乌拉坦麻醉下(1.2 g/kg, 腹腔注射)取材。

2.1.1 NPY的免疫组织化学染色：开胸暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，先以0.0l mol/L PBS(pH 7.4)100 ml快速灌注冲去血液，继之以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH 7.4)灌注固定液250 ml快速灌注固定，然后再以同样的灌注固定液250 ml缓慢滴注，持续l .5～2 h。灌注完毕后开颅取脑组织，并将所取的脑组织置于上述新鲜固定液中后固定4 h(4℃)，然后将脑组织移入含25%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中(4℃)过夜。待脑组织在蔗糖中完全沉底后，石蜡包埋。

2.1.2 Western Blotting检测：开颅骨取脑，在冰生理盐水中冲洗并在解剖显微镜下切取双测下丘脑ARC，迅速投入液氮中。将所取组织冻存于-80℃冰箱，以备检测。

2.2 NPY的免疫组织化学染色：取各组大鼠脑组织在石蜡切片机上冠状切取下丘脑含弓状核脑区，片厚7 μm，按照切片顺序隔2张取1张，切片分三组收集于含0.01 mol/L PBS(pH 7.4)的碟子中备用，每组通常包含16～18张脑组织切片。取第一套切片，按SP法免疫组化检测试剂盒的使用流程进行NPY的免疫组织化学染色。取第二套切片进行Nissl染色。以便对照观察免疫组织化学染色标记的神经元的位置。取第三套组脑组织切片，省略或用正常兔血清替代兔抗大鼠NPY抗体，后续步骤同前，进行对照实验，没有阳性结果被检测。图像信号采集分析系统对切片进行观察，NPY阳性表达呈棕黄色，正常胞核苏木素复染后呈蓝色(图1)。为了防止计数的假阳性及重复计数，只有那些具有足够亮度且能观察到胞体的神经元才被记录。而不能清楚分辨的神经元则一律舍弃不计。因此，NPY免疫阳性标记神经元数仅代表最少数量的免疫阳性神经元。

2.3 Western Blotting检测：取出待测组织，每个样品取20 mg左右，按20 mg/ml比例加入RIPA蛋白裂解液，同时添加Proteinase inhibitor cocktail(终浓度为40 μl/ml)和STI(终浓度为0.1 mg/ml)，得到组织样本的总蛋白，储存于-80℃备用，或用于含量的测定。使用BCA法进行蛋白定量。每泳道加样量均为30 μg，经过SDS-PAGE电泳，转膜，一抗孵育，二抗孵育后，ECL发光并且X胶片曝光。全自动凝胶成像系统对X胶片进行扫描分析并拍照，蛋白相对表达量用光密度表示，以GAPDH一抗作为参照来纠正加样误差。

结 果

1 免疫组织化学染色结果 在研究的三组动物中，均可在下丘脑弓状核内观察到呈现棕黄色的NPY免疫阳性的产物分布，主要在神经元胞浆中，并且该免疫阳性的神经元主要呈圆形，部分为不规则形状，直径大约15～20 μm(图1)。Evo 40 mg/kg干预后，下丘脑弓状核NPY阳性细胞数与对照组相比显著减少(P= 0.001)，Evo 4 mg/kg干预后，阳性细胞数与对照组无统计学差异(P> 0.05)(图2)。

图1 免疫组化染色结果显示不同处理组下丘脑弓状核内NPY免疫阳性的表达(NPY免疫阳性的产物分布在ARC内的神经元的胞浆，呈棕黄色，多数为圆形，部分为不规则形。其中，A为下丘脑ARC的Nissl染色图；B、C和D分别为对照组、Evo 4 mg/kg干预组和Evo 40 mg/kg干预组ARC内的NPY免疫组化染色的高倍放大图。标尺：A = 400μm，B、C、D = 50 μm)

2 Western Blotting结果 应用Western Blotting方法检测了下丘脑弓状核促摄食肽NPY的表达(图3)。Evo 40 mg/kg干预后，NPY与GAPDH的光密度比率同对照组相比显著降低(P< 0.05)；Evo 4 mg/kg干预后，NPY与GAPDH的光密度比率同对照组相比无显著变化(P> 0.05)(图4)。

图2 Evo 40 mg/kg干预大鼠后，下丘脑弓状核NPY阳性细胞数显著少于对照组(***P=0.001)；Evo4mg/kg干预后阳性细胞数与对照组比较无统计学差异(P>0.05)

图3 各组NPY免疫印迹条带[1：对照组；2：Evo 4 mg/kg处理组；3：Evo 40 mg/kg处理组。用药组随着用药量的增大，NPY的表达量逐渐降低。NPY Mol wt: 8 kDa(NPY抗体是以Ncbi 数据库中NPY-97个氨基酸序列为标准设计的，包含前信号肽，抗原结合位点是：P-G-D-E-A-P-A-E-D-M-A-R-Y)，内参GAPDH：36 kDa]

图4 Evo对下丘脑ARC中NPY蛋白水平的影响 (Evo 40 mg/kg干预后，NPY与GAPDH的光密度比率同对照组相比，差异有统计学意义；Evo 4 mg/kg干预后，NPY与GAPDH的光密度比率同对照组相比，差异无统计学意义)

讨 论

我们的研究显示，Evo 40 mg/kg灌胃，大鼠下丘脑弓状核NPY蛋白水平表达与对照组相比显著降低。前期研究结果[5-6]显示,Evo干预后大鼠摄食量及体重显著下降，血清Leptin水平增高，显著抑制下丘脑NPY mRNA的表达，因此，我们认为Evo抑制NPY蛋白水平的表达在抑制摄食中发挥关键作用。提示NPY蛋白水平的降低在Evo调控摄食、体重的机制中发挥关键作用。

实验证明，ARC-PVN轴NPY释放增加与摄食行为的启动有关，禁食时NPY增加。应用药理学、生理学或基因干预的方法，实验性降低NPY与其受体Y1、Y5的作用可以抑制食欲，说明NPY是大脑的自然食欲发生器[7-9]。EVO通过散热和产热分散食物热量，增加能量消耗，抑制内脏周围脂肪和体重增加[10]。NPY是生理性食欲启动子，下丘脑NPY释放的异常，可产生过食、能量消耗的降低及一系列新陈代谢性疾病。因此，针对ARC-PVN神经轴，研究有效调控NPY的药物，避免或减缓这些疾病的发生和发展是临床迫在眉睫的课题。

转基因肥胖模型中，NPY不适当和无限制地过度表达引起肥胖，这是由于Leptin对这些神经元的正常抑制作用缺失所导致，包括：①ob/ob小鼠：无生物功能Leptin；②db/db小鼠和fa/fa fatty Zucker大鼠：Leptin受体突变[11-12]。在这些模型中，NPY mRNA表达增加伴随NPY蛋白水平在ARC、PVN、DMH核团中增高，结果与禁食和IDDM模型表现一致[13]。

在本研究中，Evo 40 mg/kg显著下调大鼠下丘脑弓状核NPY蛋白水平的表达，而我们的前期结果显示Evo明显升高血清Leptin水平，显著抑制下丘脑NPY mRNA的表达，因此，我们认为Evo抑制NPY蛋白水平的表达在抑制摄食中发挥关键作用。提示NPY蛋白水平的降低在Evo调控摄食、体重的机制中发挥关键作用。

[1] Wang T, Wang Y, Kontani Y,etal. Evodiamine improves diet-induced obesity in a UCP1-independent manner: Involvement of anti-adipogenic mechanism and ERK/MAPK signaling[J]. Endocrinology, 2008, 149:358-366.

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[6] 施京红，闫剑群，丁 辉. 吴茱萸碱对大鼠体重及血清瘦素水平的影响[J]. 陕西中医，2009，30(10)：1425-1426.

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(收稿：2014-11-07)

Influence of evodiamine on the expresstion of peptide NPY in hypothalamic ARC in rats

Department of Medical Techniques, Immunology and Science of Inspection Teaching and Research Section,Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Shi Jinghong Wang Ping Xu Bin et al

Objective: To investigate the effect of evodiamine (Evo) on the expresstion of peptide NPY in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus in rats. Methods: Male Sprague-Dawley rats (5 weeks old,n=36) were randomly divided into three groups (n=12). Intragastric administration of Evo 40 mg/kg, Evo 4 mg/kg or water was infused for 25 days, once a day. We evaluated the effect of Evo on NPY peptide expression. NPY was detected by immunohistochemistry in cytoplasm of the hypothalamic ARC. The expression of peptide NPY in hypothalamic ARC was measured by Western Blotting. Results: The frequency of NPY-IR neurons of Evo 40 mg/kg was significantly smaller than control group. The expression of orexigenic peptide NPY in hypothalamic ARC of the animals treated with Evo 40 mg/kg (Ratio of light density between NPY and GAPDH) had a noticeable drop compared with the control group. Conclusion: Our results show that intragastric administration of Evo (40 mg/kg) decreased orexigenic NPY peptide level in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus. This is one of the most important mechanisms of Evo in the hypothalamus.

Evodiamine/pharmacology NeuropeptideY Arcuate nucleus Hypothalamus Immunohistochemistry Rats

* 陕西省教育厅课题(2010JK489)

吴茱萸碱/药理学 神经肽Y 弓状核 下丘脑 免疫组织化学 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.001

△ 陕西省中医医院