一种同时进行牛囊胚差异染色和凋亡染色的方法

孙尉峻，于学颖，2，胡庭溪，3，郭芹芹，刘 岩，郝海生，赵学明，朱化彬，杜卫华*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.河北工程大学，邯郸 056000；3.甘肃农业大学，兰州 730070)

一种同时进行牛囊胚差异染色和凋亡染色的方法

孙尉峻1，于学颖1，2，胡庭溪1，3，郭芹芹1，刘 岩1，郝海生1，赵学明1，朱化彬1，杜卫华1*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.河北工程大学，邯郸 056000；3.甘肃农业大学，兰州 730070)

旨在优化双重荧光染色方法的基础上，建立囊胚的三重免疫荧光染色方法，以期更经济、高效、准确地评估胚胎质量。三重免疫荧光染色方法分别用CDX2蛋白、caspase-3蛋白和Hochest 33342标记囊胚的滋养层细胞、凋亡细胞和所有细胞的细胞核，共3种染色方案。双重荧光染色方法采用PI染色滋养层细胞，或通过TUNEL法进行凋亡细胞染色；而囊胚细胞的细胞核用Hochest33342染色。结果表明，三重免疫荧光染色方法获得的图像清晰，能准确地标记囊胚中的各类细胞。另外，比较3种染色方案的准确性、复杂性及染色效果，确定两种一抗或两种二抗共同孵育的方案准确度高、效果好、且用时最短，为最佳染色方案。综上表明，在同一枚囊胚中，通过标记CDX2和caspase-3蛋白来鉴定其滋养层细胞和凋亡细胞，并进行囊胚质量的评估是可行的，而且较双重荧光染色有较大的优势。

囊胚质量；三重免疫荧光染色；CDX2；caspase-3

随着哺乳动物胚胎生物技术的不断发展，体外胚胎生产效率不断提高，同时，体外胚胎质量也同样不容忽视。优质胚胎对非同步化环境的忍耐性较高，反之劣质胚胎对非同步化环境的耐受性极低，因此胚胎质量的好坏直接关乎胚胎移植后妊娠率、成活率及畸形率。目前评估胚胎质量的方法有多种，但较为普遍使用的仍为胚胎形态学评估[1]。胚胎发育至桑椹胚阶段，发生第一次分化：滋养层细胞和内细胞团的分化[2]。在囊胚阶段，劣质胚胎易发生不同程度的细胞凋亡、DNA断裂等，以导致细胞死亡。因此囊胚总细胞数、内细胞团细胞比例成为真实反映胚胎质量的参考指标[3]。另外，细胞凋亡的检测也逐渐成为评价胚胎质量的一个重要指标，通常使用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色进行检测[4]。

目前较为常见的荧光染色方法为双重荧光染色，即用两种不同染料分别标记不同类型细胞，进而对各个类型细胞数目进行计数并统计[5-6]。随着技术的不断进步，染色方法流程逐步简化且准确性提高。S.M.Hosseini等[7]使用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)分别标记囊胚总细胞和凋亡细胞，进而计算细胞凋亡率，建立了非常快捷的染色方法；D.Strumpf等[8]证明尾型同源框转录因子蛋白2(CDX2)在内细胞团与滋养层细胞分化过程中的关键作用，且在滋养层细胞中特异性表达，因此通过标记CDX2进而可以区分出滋养层细胞。

为了更全面、准确、经济地评估胚胎质量，E.Wydooghe等[2]在同一枚囊胚使用3种荧光分别标记囊胚总细胞、滋养层细胞和凋亡细胞。其使用Hochest 33342和CDX2分别标记囊胚总细胞和滋养层细胞，另外使用细胞凋亡通路中关键蛋白caspase-3标记凋亡细胞，可以较全面地评估囊胚质量。但是该程序较为复杂且周期较长，本研究以E.Wydooghe等[2]研究为基础，建立更为简单快捷的三重免疫荧光染色方法，为胚胎质量评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

所有试剂如无特殊说明均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。CDX2(鼠抗)一抗购自美国Biogenex公司，caspase-3(兔抗)一抗购自美国Cell Signaling Technology公司，Alexa Fluor 488(羊抗鼠)二抗和Alexa Fluor 594(羊抗兔)二抗均购自美国Life Technologies公司。

1.2 卵母细胞的采集和体外成熟

从屠宰场采集牛卵巢，置于37 ℃生理盐水中，3 h内送至实验室。使用含青霉素和链霉素的温热生理盐水将卵巢清洗3～5次后，用真空蠕动泵抽取5～8 mm卵泡中的卵泡液。在体视显微镜下挑选卵母细胞-卵丘细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes，COCs)，用成熟液(含0.01 IU·L-1FSH、10 IU·L-1LH、1 μg·mL-1雌二醇、100 ng·mL-1IGF、50 ng·mL-1EGF、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素、10%胎牛血清的TCM 199培养液)洗涤后，放入含有成熟液并覆盖矿物油的四孔板中，每孔培养50枚COCs，在38.5 ℃、5% CO2和100%湿度条件下培养22～24 h。

1.3 体外受精

将COCs从成熟培养液中移入50 μL受精滴(含10 μg·mL-1肝素、4 mg·mL-1BSA的Brackett-Oliphant液[9])中，每滴15枚。38 ℃水浴解冻精液，使用5 mL洗精液(含10 μg·mL-1肝素、4 mg·mL-1BSA、10 mol·L-1咖啡因的Brackett-Oliphant液)在500 g离心5 min洗涤；弃上清，再加入5 mL洗精液离心5 min，弃上清，用洗精液调整精子浓度，使精子浓度约为2×107mL-1。取50 μL精液，与含有COCs的受精滴混合成100 μL液滴，38.5 ℃、5% CO2气体和100%湿度条件下精卵共孵育。

1.4 胚胎的体外培养

精卵共孵育8 h后，取出受精卵，用1 mg·mL-1的透明质酸酶处理3 min，然后用移液枪反复吹打，直至卵丘细胞基本脱落；用含10% FBS的TCM 199终止透明质酸酶的消化，口吸管将受精卵在前期培养液(含109.5 mol·L-1NaCl、3.1 mol·L-1KCl、26.2 mol·L-1NaHCO3、0.8 mol·L-1MgCl2·6H2O、1.19 mol·L-1KH2PO3、0.4 mol·L-1丙酮酸钠、1.5 mol·L-1葡萄糖、5 mol·L-1半乳糖酸钙、6 mg·mL-1BSA、1 mol·L-1L-谷氨酰胺、2%必需氨基酸、1%非必须氨基酸)中洗3次后，放入前期培养液滴中进行培养。48 h后，将卵裂至4-～8-细胞的胚胎移至后期培养液(含109.5 mol·L-1NaCl、3.1 mol·L-1KCl、26.2 mol·L-1NaHCO3、0.8 mol·L-1MgCl2·6H2O、1.19 mol·L-1KH2PO3、0.4 mol·L-1丙酮酸钠、1.5 mol·L-1葡萄糖、5 mol·L-1半乳糖酸钙、10% FBS、1 mol·L-1L-谷氨酰胺、2%必需氨基酸、1%非必须氨基酸)滴中，48 h后半量更换胚胎培养液。第7天获得囊胚。

1.5 胚胎的免疫荧光染色

固定和通透：培养7 d后获得的牛体外受精囊胚用37 ℃、0.5% PBS-BSA(含有0.5%BSA的PBS溶液)清洗3次，每次2 min。2%多聚甲醛固定囊胚20 min，并于通透液(含0.5% Triton X-100和0.05% Tween-20的PBS溶液)中室温处理30 min，按照每枚囊胚20 μL通透液。0.5%PBS-BSA于室温清洗经通透处理的囊胚3次，每次2 min。

囊胚CDX2蛋白的变性和封闭：取出囊胚，在1 mol·L-1HCl中室温处理30 min，然后迅速转移至100 mmol·L-1TrisHCl中，室温处理20 min。处理后室温下使用0.5% PBS-BSA中清洗3次，每次5 min。将囊胚移至封闭液(含10% 山羊血清和0.05% Tween-20的PBS溶液)中，4 ℃封闭过夜。

一抗孵育：取出囊胚放入1∶500封闭液稀释的一抗中，37 ℃孵育2 h。二抗孵育：一抗孵育完成后，囊胚用0.5% PBS-BSA中洗3次，每次10 min以上。然后放入1∶500封闭液稀释的二抗中，室温避光孵育2 h。

囊胚细胞核染色：用0.5% PBS-BSA中清洗囊胚3次，每次10 min。然后将囊胚于20 μmol·L-1Hochest33342中室温孵育10 min，取出囊胚并使用0.5% PBS-BSA中洗3次后备用，该过程需要在避光条件下完成，以防止荧光淬灭。

压片及拍照：取抗淬灭剂DABCO 5 μL滴于载玻片，用口吸管将1～3枚囊胚放在DABCO液滴上，并且在液滴附近点少量凡士林以固定盖玻片。将盖玻片轻轻压在液滴上，与凡士林充分接触并适当施加压力使囊胚充分延展，切忌侧向滑动载玻片。将囊胚放于荧光显微镜下观察，并用CCD系统拍照。蓝色荧光使用UV光激发(EX 330-380，DM 400)、绿色荧光使用蓝光激发(EX 450-490，DM 505)、红色荧光使用绿光激发(EX 510-560，DM 575)。

1.6 PI/Hochest33342鉴定滋养层细胞数

洗涤和通透：培养至7 d的囊胚室温下使用含0.1%PVA的PBS溶液洗涤3次以上，然后将胚胎转移至含有0.5%Triton X-100的PBS溶液中进行通透，精确计时20 s后，迅速将囊胚移至含0.1% PVA的PBS溶液中洗涤。

PI/Hochest33342着色：将胚胎移入20 μg·mL-1PI溶液中进行囊胚最外层细胞的染色，共染色50 s，迅速取出囊胚清洗3次以上，然后将囊胚于20 μmol·L-1Hochest 33342中室温孵育10 min，进行总细胞数染色。

压片及拍照：方法同1.5。

1.7 TUNEL检测凋亡细胞数

固定和通透：方法同1.5。

TUNEL 染色：将胚胎洗涤3次后，放入TUNEL工作液(InsituCell Death Detection Kit，Roche，瑞士)在38.5 ℃培养箱中孵育1 h。取出胚胎洗涤3次后，用20 μmol·L-1Hochest33342室温孵育10 min，然后进行压片拍照，压片拍照过程同1.5。

1.8 试验设计

采用体外受精方法获得牛囊胚，在体外培养过程中分别统计囊胚的卵裂率和囊胚率。其中，卵裂率=卵裂胚胎/卵母细胞总数，囊胚率=囊胚个数/卵母细胞总数。然后分别对囊胚进行传统双重荧光染色和三重免疫荧光染色差异，比较每种染色方法准确性、染色效果和所需时间。双重染色设计为两组，一组为PI/Hochest33342鉴定滋养层细胞数，另一组为TUNEL检测凋亡细胞数。

三重免疫荧光染色共设计3个方案，方案A：分别孵育CDX2一抗与caspase-3一抗，再分别孵育Alexa Fluor 488二抗和Alexa Fluor 594二抗；方案B：共同孵育CDX2一抗与caspase-3一抗，再分别孵育Alexa Fluor 488二抗和Alexa Fluor 594二抗；方案C：共同孵育CDX2一抗与cleaved caspase-3一抗，然后共同孵育 Alexa Fluor 488二抗和Alexa Fluor 594二抗。每个试验重复3次，每次至少10个囊胚进行染色。内细胞团比例(ICM/TCN)=(总细胞数-滋养层细胞数)/总细胞数，凋亡细胞比例(Apoptotic cells ratio，ACR)=凋亡细胞数/总细胞数。

1.9 统计分析

囊胚细胞使用Photoshop CS5(Adobe，美国)计数功能进行计数。数据统计使用SAS9.2(SAS Institute，美国)进行单因素方差分析，数据使用“平均值±标准差”表示，P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 牛体外受精囊胚的获得

共采集50对牛卵巢，收集430枚卵母细胞进行体外受精，体外受精胚胎卵裂率为81%，囊胚率42%，从囊胚中挑选扩张囊胚160枚，进行后续的染色试验(图1)。

2.2 牛扩张囊胚细胞计数

免疫荧光染色，分别对牛囊胚总细胞(蓝色)、滋养层细胞(绿色)和凋亡细胞(红色)进行计数，其中内细胞团细胞数(ICM)=总细胞数(Total cell number，TCN)-滋养层细胞数(TE)。结果(表1)显示，不同染色方法获得的囊胚总细胞数和凋亡细胞比例间差异均不显著(P>0.05)；对于内细胞团比例，PI/Hochest33342染色组显著低于其余各组(P<0.05)，而其余各组之间差异不显著(P>0.05)。

图1 牛卵母细胞、2-细胞胚胎及囊胚Fig.1 Bovine oocytes，2-cell stage embryos and blastocysts

表1 不同染色方法获得的牛囊胚总细胞数、内细胞比例和凋亡比例

Table 1 The TCN，ICM/TCN and ACR of bovine blastocysts using different methods

组别Groups囊胚数No．ofblastocysts染色用时/hStainingduration总细胞数TCN内细胞团比例/%ICM/TCN凋亡细胞比例∗/%ACR方案AProtocolA301685．48±15．26a39．91±11．51a6．81±4．01a方案BProtocolB301487．67±16．15a42．65±10．91a5．81±3．12a方案CProtocolC301285．91±17．11a39．88±8．51a6．69±2．76aPI/Hochest3334230190．33±7．51a30．97±15．6b———TUNEL30283．67±6．03a———6．77±4．20a

同列数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。*由于凋亡细胞比例均小于30%，服从二项分布，因此需要进行反正弦代换后进行统计

In the same column，values with same letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)，while with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05).*ACR was less than 30%，which obey the binomial distribution and so the arcsine transformation should be done before statistics

2.3 牛扩张囊胚不同荧光染色效果的比较

采用不同荧光染色方法，囊胚细胞均清晰可辨(图2)。在三重和双重染色方法中，均采用Hochest33342进行囊胚总细胞数的标记，呈现蓝色。对于滋养层细胞数，三重染色方法用携带Alexa Fluor 488荧光基团的二抗进行标记而呈现绿色；双重染色方法中滋养层细胞被通透打孔后,PI染料进入胞内而呈现红色，但TUNEL方法则不能区分滋养层细胞。对凋亡细胞TUNEL染色方法中，采用携带有FITC的dUTP进入胞内呈现绿色，而三重染色方法则Alexa Fluor 594荧光基团而呈现红色；而PI/Hochest33342方法则不能标记凋亡细胞。可见，三重免疫荧光染色可在同一枚胚胎显示3种颜色，标记3类细胞。另外，通过三重染色方法可明确凋亡细胞的发生位置，即确定凋亡发生在滋养层细胞还是内细胞团细胞，对胚胎的后期发育和胚胎质量的评估是非常重要的；而TUNEL方法虽可以判断凋亡细胞在整个囊胚所处位置，但无法区分其属于滋养层细胞还是内细胞团。

图2 不同染色方案获得的牛囊胚细胞、滋养层细胞和凋亡细胞(比例尺：100 μm)Fig.2 Bovine blastocysts cells，TE and apoptotic cells using different stain methods(The scale bar：100 μm)

3 讨 论

CDX2蛋白是一个重要的转录因子，在哺乳动物囊胚中仅存在于滋养层细胞。CDX2蛋白含有一个易被酸溶解的基团，且该基团由组蛋白和非组蛋白组成，因此，有必要对CDX2蛋白进行酸处理以暴露CDX2的抗原决定簇[10]。另外，碱性溶液对于细胞核单克隆抗体的抗原修复作用明显[11]，F.D′Amico等[12]研究证明，TrisHCl对于抗原修复的作用是最理想的，因此，本试验使用1 mol·L-1HCl处理以暴露CDX2的抗原决定簇，用pH约为8.4的TrisHCl进行抗原修复。

caspase-3蛋白为caspase蛋白家族中的一员，与caspase-8和caspase-9蛋白互作[13]。caspase-3在程序性凋亡细胞中可通过外在(程序性死亡配体)和内在(线粒体)两条途径进行激活[14-15]，caspase-3一般以未激活酶原形式存在，经水解加工，保守的天冬氨酸残基形成一大一小两个亚基，进而被激活成为cleaved caspase-3，而激活状态下的caspase-3正是细胞程序性凋亡的标志，因此选用cleaved caspase-3抗体来标记凋亡细胞。

囊胚质量是囊胚冷冻与移植后成活率的重要因素[16]，因此测定囊胚总细胞数、内细胞团比例及凋亡细胞比例有着重要的意义。本试验选取同批次生产的囊胚，且染色所用胚胎均选择扩张囊胚，在理论上各个囊胚在形态学上是非常接近的。本试验结果中，扩张囊胚的总细胞数为85.48～87.67，内细胞团比例为39.88%～42.65%，凋亡细胞比例为5.81%～6.81%，这与S.Iwasaki染色结果接近，符合牛扩张囊胚的正常指标[17]。

本研究中，三重荧光染色和双重荧光染色均使用Hochest33342进行总细胞数的标记[18]，且各组之间差异不显著(P>0.05)。根据染色效果，使用Hochest33342能清晰辨别出单个细胞，因此使用Hochest33342能准确对囊胚总细胞数进行计数。比较内细胞团比例，PI/Hochest33342染色结果显著低于其余各组(P<0.05)，其余各组之间差异不显著(P>0.05)，这是因为PI/Hochest33342染色原理是破坏囊胚最外层细胞膜的完整性，并使用PI进行标记成红色，Hochest33342用来标记所有细胞[19]。该方法能快速鉴别滋养层细胞，但由于该方法受通透时间、PI染色时间和囊胚细胞数多少的影响，染色的效果不稳定，重复性差。本试验中，使用PI/Hochest33342进行染色，结果显示内细胞团比例显著低于其他组(P<0.05)，这可能是由于通透时间过长，PI染色时间过长造成的，该方法虽然能够缩短操作时间，但并不能反映囊胚的真实形态，且不能鉴定囊胚的凋亡细胞，也成为PI/Hochest33342染色的一大缺陷。

比较凋亡细胞比例，发现各组间差异不显著(P>0.05)。W.R.Duan等[20]研究表明，激活状态下的caspase-3和TUNEL分别在不同层面体现细胞的程序性死亡，但激活后的caspase-3与真实的细胞凋亡有更好的相关性，caspase-3应是最优选择。但试验方法上，二者均可作为细胞凋亡检测使用。虽然TUNEL染色时间较短，但基于双重荧光染色的TUNEL染色法并不能体现滋养层细胞和内细胞团比例，也不能确定凋亡细胞的具体位置，而凋亡发生在滋养层细胞还是内细胞团细胞则是体外胚胎后期发育能力和质量评估的重要因素。因此通过比较，三重免疫荧光染色方案在鉴定牛胚胎质量方面具有更大的优势。

在三重荧光染色的各个方案中，方案A采用一抗分别孵育，二抗分别孵育，整个染色过程持续约16 h；方案B采用两种一抗按照1∶1比例混合后共同孵育，然后分别与两种二抗孵育，整个染色过程持续约14 h；方案C采用两种一抗按照1∶1比例混合后共同孵育，两种二抗按照1∶1比例混合后共同孵育，整个染色过程持续12 h。方案A过程较为繁琐，持续时间也较长，同时也可能造成荧光淬灭而导致荧光照片不清晰。方案C则缩短了染色时间，染色程序也进行了简化。方案B介于二者之间。据本试验结果，方案A、B和C均能很好地标记囊胚内各类细胞。另外，将两种抗体同时孵育在Western blot试验中已有应用[21]，在Western blot过程中，可将两种分子量差距较大且来源不同的两种抗体共同孵育，以节省时间并保证染色效果。本研究中，方案B均将两种一抗混合后共同孵育，均很好地显示颜色，且没有非特异性结合，这可能是由于两种一抗来源不同，其中CDX2一抗来源于鼠，cleaved caspase 3 一抗来源于兔，且CDX2蛋白已经过抗原决定簇暴露和抗原修复，两种一抗均很好地与目的蛋白结合，然后分别孵育两种二抗，降低二抗发生非特异性结合的概率。在方案C中，按照1∶1比例混合Alexa Fluor 488(羊抗鼠)和Alexa Fluor 594(羊抗兔)，两种二抗均很好地与一抗结合，且无非特异性结合，这证明对于可靠性较强的二抗来说，均能很好地与一抗识别并结合，能有效降低二抗的非特异性结合，因此也能显示出较好的染色效果。

综上表明，通过标记同一枚囊胚的CDX2蛋白及caspase-3来鉴别滋养层细胞和凋亡细胞并进行质量评估是可行的；结合染色方案的准确性、染色效果及染色程序复杂程度等因素综合分析，认为两种一抗或两种二抗共同孵育的染色方法准确性较高、染色效果较好且用时最短，极大地节省了人力物力，为最佳方案。

[1] VAN SOOM A，MATEUSEN B，LEROY J，et al.Assessment of mammalian embryo quality：what can we learn from embryo morphology?[J].ReprodBiomedOnline，2003，7(6)：664-670.

[2] WYDOOGHE E，VANDAELE L，BEEK J，et al.Differential apoptotic staining of mammalian blastocysts based on double immunofluorescent CDX2 and active caspase-3 staining[J].AnalBiochem，2011，416(2)：228-230.

[3] PARK S E，CHUNG H M，KO J J，et al.Embryotropic role of hemoglobin and ethylenediaminetetraacetic acid in preimplantation development of ICR mouse 1-cell embryos[J].FertilSteril，2000，74(5)：996-1000.

[4] FOULADI-NASHTA A A，ALBERIO R，KAFI M，et al.Differential staining combined with TUNEL labelling to detect apoptosis in preimplantation bovine embryos[J].ReprodBiomedOnline，2005，10(4)：497-502.

[5] KUNISADA T，YAMAGISHI H.Rapid microscale procedure for visualizing intracellular plasmid DNA by electron microscopy[J].Plasmid，1983，9(1)：8-16.

[6] HARDY K，HANDYSIDE A H，WINSTON R M.The human blastocyst：cell number，death and allocation during late preimplantation developmentinvitro[J].Development，1989，107(3)：597-604.

[7] HOSSEINI S M，HAJIAN M，ASGARI V，et al.Novel approach of differential staining to detect necrotic cells in preimplantation embryos[J].IntJFertilSteril，2007，1(3)：103-106.

[8] STRUMPF D，MAO C A，YAMANAKA Y，et al.CDX2 is required for correct cell fate specification and differentiation of trophectoderm in the mouse blastocyst[J].Development，2005，132(9)：2093-2102.

[9] BRACKETT B G，OLIPHANT G.Capacitation of rabbit spermatozoainvitro[J].BiolReprod，1975，12(2)：260-274.

[10] ROBBINS E，BORUN T W.The cytoplasmic synthesis of histones in hela cells and its temporal relationship to DNA replication[J].ProcNatlAcadSciUSA，1967，57(2)：409-416.

[11] KIM S H，KOOK M C，SHIN Y K，et al.Evaluation of antigen retrieval buffer systems[J].JMolHistol，2004，35(4)：409-416.

[12] D′AMICO F，SKARMOUTSOU E，STIVALA F.State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry[J].JImmunolMethods，2009，341(1-2)：1-18.

[13] HAN J，SOHN E J，KIM B，et al.Upregulation of death receptor 5 and activation of caspase 8/3 play a critical role in ergosterol peroxide induced apoptosis in DU 145 prostate cancer cells[J].CancerCellInt，2014，14(1)：117.

[14] SALVESEN G S.Caspases：opening the boxes and interpreting the arrows[J].CellDeathDiffer，2002，9(1)：3-5.

[15] GHAVAMI S，HASHEMI M，ANDE S R，et al.Apoptosis and cancer：mutations within caspase genes[J].JMedGenet，2009，46(8)：497-510.

[16] HAN Y M，YAMASHINA H，KOYAMA N，et al.Effects of quality and developmental stage on the survival of IVF-derived bovine blastocysts culturedinvitroafter freezing and thawing[J].Theriogenology，1994，42(4)：645-654.

[17] IWASAKI S，YOSHIBA N，USHIJIMA H，et al.Morphology and proportion of inner cell mass of bovine blastocysts fertilizedinvitroandinvivo[J].JReprodFert，1990，90(1)：279-284.

[18] ANTONIA GIL M，MASIDE C，CUELLO C，et al.Effects of Hoechst 33342 staining and ultraviolet irradiation on mitochondrial distribution and DNA copy number in porcine oocytes and preimplantation embryos[J].MolReprodDev，2012，79(9)：651-663.

[19] HOSSEINI S M，HAJIAN M，ASGARI V，et al.Novel approach of differential staining to detect necrotic cells in preimplantation embryos[J].IntJFertilSteril，2007，1(3)：103-106.

[20] DUAN W R，GARNER D S，WILLIAMS S D，et al.Comparison of immunohistochemistry for activated caspase-3 and cleaved cytokeratin 18 with the TUNEL method for quantification of apoptosis in histological sections of PC-3 subcutaneous xenografts[J].JPathol，2003，199(2)：221-228.

[21] 王 莉.ocLDL诱导小鼠足细胞脂质蓄积和CXCL16表达以及辛伐他汀干预的研究[D].济南：山东大学，2014． WANG L.The study on lipid accumulation and CXCL16 experession and intervention with simvastatin in mice podocytes induced by ocLDL[J].Jinan：Shandong University，2014.(in Chinese)

(编辑 程金华)

A Method Used for Differential Staining and Apoptosis Cell Staining in Bovine Blastocyst

SUN Wei-jun1，YU Xue-ying1，2，HU Ting-xi1，3，GUO Qin-qin1，LIU Yan1，HAO Hai-sheng1，ZHAO Xue-ming1，ZHU Hua-bin1，DU Wei-hua1*

(1.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；2.HebeiUniversityofEngineering，Handan056000，China；3.GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

To evaluate the quality of bovine blastocysts efficiently and accurately，a triple immunofluorescence staining method was established in bovine blastocyst.The trophectoderm(TE) cells and apoptotic cells were identified with labeling of CDX2 protein and caspase-3 protein，respectively.All of nuclei in blastocyst cells were stained with Hochest 33342.Triple staining was designed as 3 schemes.PI was used to stain nuclei of TE cells and apoptotic cells were detected by TUNEL method in double staining.The results showed that the triple immunofluorescence staining，with 3 schemes，could distinguish the TE and apoptotic cells accurately.Additionally，co-incubation of 2 first antibodys/second antibodys was the most optimal method to triple staining in terms of accuracy，efficiency and stain duration.Therefore，in same blastocyst，identification the TE and apoptotic cells by labeling CDX2 and caspase-3 protein respectively was available to evaluate the quality of bovine blastocysts.Also，there were great advantages in triple staining compared with double staining.

blastocyst quality；immunofluorescence triple-staining assay；CDX2；caspase-3

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.008

2015-02-16

基本科研业务费重点项目(2013ywf-zd-2)；国家科技支撑项目(2012BAD12B01-2)；家畜胚胎工程与繁殖创新团队(ASTIP-IAS06-2015)

孙尉峻(1989-)，男，河北张家口人，硕士生，主要从事家畜胚胎工程研究，E-mail：sunweijunet@163.com

*通信作者：杜卫华，博士，副研究员，E-mail：dwh@iascaas.net.cn

S823；S813

A

0366-6964(2015)11-1967-07