钛合金球头镀类金刚石碳膜人工髋关节磨屑分析

屈文振，廖伟雄，张 浩，李 冀，王克涛，杨以萌，李众利

解放军总医院 骨科，北京 100853

钛合金球头镀类金刚石碳膜人工髋关节磨屑分析

屈文振，廖伟雄，张 浩，李 冀，王克涛，杨以萌，李众利

解放军总医院 骨科，北京 100853

目的分析钛合金球头镀类金刚石碳(diamond-like carbon，DLC)膜人工髋关节的磨屑特征。方法实验设置3组：进口关节组(A)，钴铬钼合金球头对超高分子量聚乙烯(ultra-high molecular weight polyethylene，UHMWPE)臼杯(CoCrMo-UHMWPE，Zimmer，America)；镀膜关节组(B)，镀类金刚石碳膜钛合金球头对超高分子量聚乙烯臼杯(Ti-DLC- UHMWPE，京航，中国)；国产关节组(C)，钴铬钼合金球头对超高分子量聚乙烯臼杯(CoCrMo- UHMWPE，京航，中国)。髋关节模拟机运行0.33×106转后，收集含有磨屑的小牛血清润滑液，经酸消解过滤后，用扫描电镜-能量色散X线分析仪鉴定滤膜上的磨屑。采用Image-Pro Plus 6.0对电镜图片进行图像分析获取颗粒大小、形状、数量信息，比较各组的差异。结果能量色散X线分析显示磨屑的元素峰主要为碳(C)峰，未见明显的钴(Co)、铬(Cr)、钼(Mo)、钛(Ti)等金属元素峰。各组磨屑60%以上为类球状颗粒，粒径为0.1 ～ 40μm，0.1 ～ 1μm的颗粒数量较多，1μm以上的颗粒所占体积百分比大；B组滤膜上的磨屑数量少于另外两组。结论实验产生的磨屑主要为超高分子量聚乙烯颗粒；钛合金球头镀类金刚石碳膜人工髋关节可减少磨屑的数量。

髋假体；超高分子量聚乙烯；类金刚石碳；磨屑

人工全髋关节置换术(total hip arthroplasty，THA)经过不断发展，目前已经成为最常见的关节置换手术[1]。然而，术后假体产生的磨屑会诱发细胞反应，引起假体周围骨溶解，导致假体松动。据文献报道，每年接受关节置换手术患者术后骨溶解及关节松动的发生率达到了20%[2-3]。磨屑的类型取决于人工关节摩擦界面应用的材料和固定方式。目前，假体磨屑主要有聚合物[通常是超高分子量聚乙烯(ultra-high molecular weight polyethylene，UHMWPE)或者高交联聚乙烯]、金属(通常是钴铬钼合金CoCrMo、钛合金)、氧化铝陶瓷和骨水泥(PMMA)。其中关于UHMWP磨屑和金属磨屑的研究最多，因为金属-UHMWPE和陶瓷-UHMWPE是人工关节最常用的摩擦配伍界面。UHMWP磨屑是最主要的摩擦产物，假体周围组织消化分解后的细胞学检查发现，磨屑中70% ～ 90%都是聚乙烯颗粒[4]。金属磨屑可使局部组织或血液中金属离子含量升高，超过正常阈值，具有潜在的细胞毒性[5-6]。陶瓷材料由于其低摩擦系数的特点，产生的陶瓷磨屑少，粒径小，易碎裂是其最大的缺点[7]。传统的骨水泥固定假体会在人体内产生大量骨水泥颗粒。随着人们对假体磨屑危害认识的加深，无骨水泥的生物型固定应用越来越广泛。2012年美国93%接受THA的患者都采用了生物型固定假体[8]。研究表明，磨屑的类型、尺寸、形状、数量、表面形貌都可以影响磨屑引起细胞反应的大小。因此，准确把握磨屑特征可以更好地评估假体摩擦产物引起细胞反应的潜在能力，对于改进人工关节生物材料和假体设计有重要的参考意义。本实验收集了髋关节模拟机运行0.33×106转后含有磨屑的小牛血清润滑液，对钛合金球头镀类金刚石碳膜人工髋关节的磨屑进行了初步的定性、定量分析，并与对照组进行比较。

材料和方法

1 仪器试剂 所用试剂均为分析纯级别。37%盐酸(体积分数)，无水甲醇，蒸馏水，可换膜过滤器(直径25 mm，Millipore)，聚碳酸酯滤膜(直径25 mm，Whatman)，水浴恒温振荡器(SHZ-88，金坛市岸头仪都仪器厂)，数显电热鼓风干燥箱(HD，昆山海达精密仪器有限公司)，扫描电镜-X线能谱仪(SEM-EDS)(S-3000N，日本Hitachi)。

2 实验分组 实验设置3组：进口关节组(A)，钴铬钼合金球头对超高分子量聚乙烯臼杯(CoCrMo-UHMWPE，Zimmer，America)；镀膜关节组(B)，镀DLC膜钛合金球头对超高分子量聚乙烯臼杯(Ti-DLC-UHMWPE，京航，中国)；国产关节组(C)，钴铬钼合金球头对超高分子量聚乙烯臼杯(CoCrMo-UHMWPE，京航，中国)。

3 髋关节模拟机实验 采用蛋白质浓度为17 g/L的小牛血清(加入了0.03%叠氮化钠)作为润滑介质。Prosim髋关节模拟机运行0.33×106转后，收集血清标本，-80℃保存。

4 磨屑提取 取体积分数为37%的浓盐酸40 ml置于离心管中，加入10 ml的小牛血清标本，于50℃恒温振荡箱中放置1 h。消解完毕后(此时溶液变为紫色)，配成不同浓度，各取0.5 ml消解液，分别加入10 ml甲醇稀释(20倍组)，100 ml甲醇(200倍)稀释。将稀释后的消化溶液分别经孔径为1μm、0.1μm的聚碳酸酯膜(Whattman， British)滤膜过滤，收集每次过滤后的滤膜并做好正反标记，随后的处理中始终保持滤膜正面(含颗粒面)朝上。滤膜干燥后喷金处理增强其导电性，然后用扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)观察滤膜上磨屑的特征。

5 磨屑测量 参考Besong等[9]的方法，每个样品至少在4张颗粒无重叠的图片上测量至少150个微粒，获取相关参数(共统计2 000多颗粒)。能量色散X线分析仪(Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy，EDX)确定颗粒的元素种类，排除可能存在的污染情况。使用Image-Pro Plus 6.0对保存的SEM图片进行图像分析，测算颗粒的大小、形状、数量。参照之前研究[10]，采用二分法对颗粒形状分类：首先计算颗粒的纵横比(aspect ratio，AR)，AR≤2.4为类球状颗粒，AR＞2.4为纤维条状颗粒(包含镜下观察到的条状、棒状及部分片块状颗粒)。采用以下公式估算整张滤膜上的磨屑数量和体积：

N：1张滤膜上的磨屑数量；n：观察视野下的颗粒数；V：1张滤膜上的磨屑体积；v：观察视野下的颗粒体积；S：滤膜的面积；s：观察视野的面积。文献报道，通过原子力显微镜观察测出滤膜上颗粒的厚度，线性回归法确定颗粒厚度约为等效圆直径(equivalent circle diameter，ECD)的1/3[11]，颗粒体积计算公式：

V粒：颗粒体积；S粒：颗粒在滤膜上的二维投影面积；ECD：与颗粒投影面积相等的圆的直径。

结 果

1 不同稀释倍数下滤膜上的颗粒密度对比 血清消化溶液在不同的稀释倍数下过滤后，扫面电镜下所见滤膜上颗粒分布的密度不同：20倍组滤膜上颗粒比较密集，颗粒相互重叠、聚集成团的较多(图1)，几乎看不到滤膜、滤孔。稀释200倍组的颗粒分布较均匀，出现团聚的情况较少，背景滤膜和滤孔清晰可见(图1)。

2 颗粒成分鉴定 对样品随机抽选的区域颗粒进行X线能谱分析(稀释20倍条件下)，颗粒C、O能谱峰最明显，未见明显的Co、Cr、Mo、Ti元素峰。定量结果显示，C、O元素所占比例达95%以上，而Co、Cr、Mo、Ti元素合计不到1%(图2)。颗粒中主要为非金属成分，参考ISO 17853和以前文献中关于UHMWPE的研究和电镜图片[12-13]，可判断滤膜上的颗粒主要为UHMWPE颗粒。

3 颗粒形态分析 电镜下观察，可见到各组磨屑呈现类球状、条状、杆状、片状、团块状(图3)。观察中发现，颗粒的尺寸越大，其形态越多变、表面形貌越复杂。而尺寸越小的磨粒其轮廓越规则、表面越光滑，呈现类球状。大粒径的磨粒分布不均匀，容易有小颗粒附着，形成粘连团聚。更有某些看似大粒径的颗粒完全由小颗粒聚集而成。各组磨屑的形态均以类球状为主，0.1μm滤膜和1μm滤膜上类球状颗粒数量百分比均占到60%以上(图4)。

4 颗粒的粒径、数量和体积 颗粒的粒径分布范围为0.1 ～ 40μm，0.1μm滤膜上90%的颗粒ECD为0.1 ～ 0.5μm，1μm滤膜上90%的颗粒ECD为1 ～ 10μm。各组数量、体积分布规律一致。0.1 ～ 1μm的颗粒数量较多，占到整张滤膜上颗粒数量的98% ～ 99%，但所占整张滤膜上颗粒体积比不到6%；1μm以上的颗粒体积较大，占到整张滤膜上颗粒体积的94% ～ 98%，但数量仅占整张滤膜上颗粒数的1% ～ 2%(图5 ～图6)。B组滤膜上颗粒总数量最少，其次是A组，C组颗粒数量最高(图7)。B组滤膜上颗粒总体积最大，其次是A组，C组颗粒体积最小(图8)。

图 1 B组滤膜上磨屑SEM图片 A:消化溶液稀释20倍； B:消化溶液稀释200倍Fig. 1 SEM picture of debris on filter in group B A: digestion solution diluted 20 times; B: digestion solution diluted 200 times

图 2 滤膜上不同区域颗粒的EDX分析Fig. 2 EDX analysis of debris on filter in different fields

讨 论

国外最早在20世纪60年代末就开始了体外关节模拟机实验[14]，国内的人工关节摩擦实验起步较晚，而且往往侧重于对不同材料界面、不同介质中的摩擦系数、磨损体积和磨损率的考察，而对直接引起生物学反应的磨屑研究较少。磨屑不同的种类、尺寸、数量和形态反映了不同的磨损形式、机制和潜在引起生物学反应的能力，含有重要的摩擦学信息。文献报道，几种常见的磨屑中，钛颗粒激活巨噬细胞的作用最小[15]。不规则颗粒和0.1 ～ 10μm的颗粒比其他颗粒更强烈地激活巨噬细胞[16]。表面越粗糙、形状越不规则的磨屑引起的细胞反应越重[10]。因此，磨屑的特征，对于人工关节摩擦界面生物材料的性能评估有着重要参考意义。

由于血清消化溶液中的磨屑含量未知，不同的稀释倍数可极大影响电镜观察滤膜上磨屑的图片质量。实验中发现，血清消化溶液稀释20倍时电镜观察到滤膜上颗粒密集，磨屑成团成片分布，有利于EDX集中分析磨屑的元素组成，却不利于单个颗粒的测量。而血清消化溶液稀释200倍滤膜上的颗粒分布均匀，背景清晰，便于单个颗粒的参数测量和计数工作。20倍和200倍的稀释条件可在磨屑分析实验中互补运用。

磨屑不同的形态反映了不同的磨损机制。类球状颗粒数量较多，粒径较小，在颗粒分散好、无重叠的视野中容易观察到(0.1μm滤膜多见)，多为假体界面轻度黏着磨损或腐蚀磨损过程中产生。条状、杆棒状颗粒是由于假体材料表面撕裂，脱落的颗粒受到反复摩擦碾压形成，见于严重的黏着磨损或磨粒磨损。碎片状颗粒边缘整齐，表面光滑，有时呈现折叠卷曲状，考虑为从假体表面分层剥落产生的颗粒，多见于疲劳磨损。观察到的团块状颗粒中，多数形状不规则，表面毛糙，存在小颗粒的附着、聚集，部分表面还有裂隙。少数团块颗粒轮廓清晰、形态完整、表面光滑、体积巨大，考虑为整块从假体界面的脱落，多发生在初期的磨合磨损阶段和后期的剧烈磨损阶段。

图 3 颗粒形态 A：类球状颗粒(×8 000)； B: 团块状颗粒(×800)； C：棒状颗粒(×800)； D：条状(撕裂状)颗粒(×10 000)；E：碎片状颗粒(×800)； F：大颗粒轮廓不清，表面形貌复杂；小颗粒轮廓清晰，表面光滑(×8 000)Fig. 3 Morphology of debris A： globe-like debris (×8 000)； B: block debris (×800)； C： rod-like debris (×800)； D：tear debris (×10 000)； E：flake debris (×800)； F： large debris with unclear outline and coarse surface, while small debris with clear outline and smooth surface (×8 000)

图 4 各组类球状颗粒的比例Fig. 4 Globe-like debris proportion in all groups

图 5 0.1μm滤膜上颗粒数量(A)和体积(B)占比Fig. 5 Proportion of number (A) and volume (B) of debris on 0.1μm filter

图 6 磨屑粒径分布： 0.1μm滤膜(A)和1μm滤膜(B)Fig. 6 Distribution of debris size on 0.1μm filter (A) and 1μm filter (B)

图 7 滤膜上颗粒数量Fig. 7 Number of debris on filter

图 8 滤膜上颗粒体积Fig. 8 Volume of debris on filter

人工关节磨屑的研究中发现，引起细胞反应的亚微米级、纳米级颗粒数量众多，所占的体积却不大；大颗粒体积大，数量却少，与周围组织接触面积有限。我们更关心特定尺寸范围的数量分布。Hallab和Jacobs[3]的研究显示，植入假体聚合物颗粒直径范围0.23 ～ 1μm，从人体回收的磨屑70% ～90%都为亚微米级别。Visentin等[17]从假体周围组织和关节滑液中提取的聚乙烯颗粒ECD为0.48 ～0.95μm。Affatato等[18]发现，关节模拟机上80%的超高分子量聚乙烯颗粒ECD为0.2 ～ 0.6μm。

本实验对小牛血清消解液采用1μm、0.1μm的滤膜梯度过滤，计算滤膜上磨屑的粒度分布，0.1μm以下的颗粒未纳入检测。结果发现，0.1 ～1μm的颗粒在滤膜上分布均匀，数量众多，占磨屑总数量的95%以上；长径10μm以上的颗粒数量较少，抽样视野中未见到50μm以上的颗粒。该结果与以前的研究结果一致，反应了假体早期磨损的颗粒分布特征，颗粒数量明显呈随粒径递减的偏态分布，提示磨屑中可能存在更多未观察到的纳米级的颗粒。B组(镀膜实验组)产生的磨屑总体积最大，但磨屑的数量最少；C组磨屑总体积最小，而磨屑数量却最多。这种反差说明了镀膜组产生的磨屑粒径较大，而磨屑的数量反而较少。提示镀膜假体的保护性作用在于减少磨屑的数量，而并不一定能减少磨屑的体积，单从假体的磨损体积分析并不能反映真实的情况。

综上所述，本实验中纳米碳多层膜镀膜人工髋关节产生的磨屑主要为UHMWPE颗粒，粒径多分布在1μm以下，形状以类球状为主；与对照组比较，钛合金球头镀纳米碳多层膜人工髋关节产生的磨损颗粒数量较少，1μm以下的免疫激活能力强的颗粒含量更低。

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Wear particles analysis of Ti alloy femoral heads with diamond-like carbon coating

QU Wenzhen, LIAO Weixiong, ZHANG Hao, LI Ji, WANG Ketao, YANG Yimeng, LI Zhongli
Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

LI Zhongli． Email: lizhongli@263．net

ObjectiveTo identify the characteristics of wear particles generated by Ti alloy femoral head coated by diamondlike carbon (DLC) film on hip simulator．MethodsThree groups of artificial femoral head were studied in this research, Group A: CoCrMo alloy femoral head against ultra-high molecular weight polyethylene (UHMWPE) acetabular cup (CoCrMo- UHMWPE，Zimmer, America); Group B: Ti alloy femoral head with diamond-like carbon coating against UHMWPE acetabular cup (Ti-DLCUHMWPE, Jinghang, China); Group C: CoCrMo alloy femoral head against UHMWPE acetabular cup (CoCrMo- UHMWPE, Jinghang, China)． Fetal bovine serum lubricant was collected respectively from each group after 0．33 million circles (mc)． Then the bovine serum was digested by adding acid and filtered through polycarbonate． The characteristics of particles of each group were determined by scanning electron microscope-energy dispersion X-ray analysis (SEM-EDX)． The size, shape and number of particles were measured with Image-Pro Plus6．0 on SEM pictures．ResultsThe energy dispersion X-ray analysis (EDX) showed that the main element was carbon． No marked cobalt, chromium, molybdenum, titanium was detected． Over 60% of the particles were globe-like in all groups． The particle size varied from 0．1 to 40μm, most of which ranged from 0．1 to 1μm． Particles with diameter over 1μm had a large proportion in volume． The number of particles on filter in group B was less than other groups．ConclusionThe wear particles are predominately UHMWPE particles． Artificial femoral heads with DLC coating produce less wear particles．

hip prosthesis; ultra-high molecular weight polyethylene; diamond-like carbon; wear debris

R 318

A

2095-5227(2015)12-1217-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.016

时间：2015-11-11 10:35:07

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20151111.1035.008.html

2015-04-15

国家科技支撑计划项目(2012BAI18B04)

Supported by the National Key Technology R&D Program(2012BAI18B04)

屈文振，男，在读硕士。研究方向：关节外科与运动医学。Email: qwz8519@163.com

李众利，男，主任医师，教授，博士生导师。Email: lizh ongli@263.net