免疫细胞治疗对晚期胃癌患者外周血记忆T细胞的影响

李则学，张 兰，李沛雨

解放军总医院 普通外科研究所，北京 100853

免疫细胞治疗对晚期胃癌患者外周血记忆T细胞的影响

李则学，张 兰，李沛雨

解放军总医院 普通外科研究所，北京 100853

目的初步研究免疫细胞治疗对胃癌患者免疫记忆状态的影响。方法2013年10月- 2015年2月在我院普通外科行胃癌根治术的253例患者按照是否经过树突细胞、细胞毒性T淋巴细胞免疫细胞治疗分组，其中免疫治疗组72例，对照组181例，运用流式细胞术检测患者外周血CD4+TCM(CD4+CD45RO+CD62L+)、CD8+TCM(CD8+CD45RO+CD62L+)、CD4+TEM(CD4+CD45RO+CD62L-)及CD8+TEM(CD8+CD45RO+CD62L-)比例，分析晚期胃癌患者免疫记忆状态，并进一步分析免疫细胞治疗对免疫记忆形成的影响。结果胃癌患者中，CD4+T细胞中以TCM为主，为54.52%±12.76%；而CD8+T细胞中以TEM为主，为24.49%±11.39%。相比对照组，免疫治疗组外周血中CD8+TCM比例显著降低(对照组31.59%±9.29%，免疫治疗组24.26%±7.71%，P=0.025)，CD4+TCM比例显著降低(免疫治疗组47.86%±11.77%，对照组60.00%±11.05%，P=0.006)，CD8+TEM显著升高(对照组20.00%±8.43%；免疫治疗组29.93%±12.40%，P=0.013)。结论记忆T细胞可以有效评价胃癌患者抗肿瘤特异性免疫状态，且免疫细胞治疗可以有效重建胃癌患者抗肿瘤免疫记忆。

胃癌；T淋巴细胞亚群；记忆T细胞；免疫细胞治疗

胃癌是消化道常见肿瘤，诊断时常为晚期，发病率和死亡率较高[1-4]。机体免疫紊乱是肿瘤发生发展的重要基础，评估肿瘤患者免疫状态是免疫治疗肿瘤的前提，但免疫的复杂性导致评估困难，进而成为肿瘤免疫治疗及疗效监测的障碍。研究证实，记忆T细胞在晚期肿瘤发生发展中具有重要作用[5-6]，可以介导持久的抗肿瘤特异性免疫，其在肿瘤患者体内的维持水平与肿瘤患者免疫治疗效果密切相关[6-7]。因此，本研究对胃癌患者外周血记忆T细胞特征进行分析，研究免疫细胞治疗对胃癌患者外周血记忆T细胞的影响，探索免疫细胞治疗恢复抗肿瘤免疫内在机制。

对象和方法

1 研究对象 2013年10月- 2015年2月在本院普通外科行胃癌根治术的253例患者，均经术后病理检查确诊，其中男165例，女88例，年龄23 ～ 84岁，平均52岁。接受手术联合树突细胞(dendritic cells，DC) + 细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTL)(CD8+CD45RO+CD62L+比例＞60%)治疗的患者作为免疫治疗组，共72例，仅接受手术治疗的作为对照组，共181例，两组患者年龄、性别、病理类型及分期、临床分期及手术方式差异无统计学意义。见表1。

表1 两组胃癌患者临床资料比较Tab. 1 Clinical characteristics of immunotherapy group and control group (n, %)

2 免疫治疗 术前采集外周血50 ml，分离培养扩增淋巴细胞，分别在术后9 d、12 d和14 d回输DC细胞、CTL细胞。

3 外周血T细胞检测 分别于术前1 d和术后1个月门诊复查时采外周血5 ml用于检测免疫记忆细胞。人淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物所。PerCP标记抗人CD4单克隆抗体、FITC标记抗人CD8单克隆抗体、APC标记抗CD45RO单克隆抗体、PE标记抗人CD62L单克隆抗体均购自美国BD公司，胎牛血清(FBS)购自北京元亨金马生物技术公司。取外周血20 ml，与等体积0.9%氯化钠注射液混匀，铺在等体积的分离液上，以2 300 r/min离心22 min；收集白膜层，用0.9%氯化钠注射液洗涤1 ～ 2次，2 300 r/min离心10 min，弃上清后收获细胞。取1×106个细胞，加入CD8-FITC/CD62L-PE/CD4-PerCP/CD45RO-APC抗体，混匀后常温避光反应30 min，洗涤2次(1 200 r/ min，离心5 min)，悬浮于500μl PBS中，4℃保存。荧光抗体染色完成后，应用流式细胞仪检测细胞，并用CellQuest软件分析。

4 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，定量资料采用表示，两个独立样本均数比较采用t检验，定性资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 胃癌患者术前免疫记忆状态 根据T细胞表面分子CD45RO及CD62L的表达与否将T细胞分为两种类型：CD45RO+CD62L+中央型记忆T细胞(TCM)和CD45RO+CD62L-效应型记忆T细胞(TEM)。对253例胃癌患者外周血中CD4+T及CD8+T细胞分群分析后，CD4+中央型记忆T细胞占54.52%±12.76%，CD4+效应型记忆T细胞占15.60%±10.17%，可见CD4+T细胞中以中央型记忆T细胞为主，占总数约60%。CD8+中央型记忆T细胞占28.28%±9.25%，CD8+效应型记忆T细胞占24.49%±11.39%。

2 免疫细胞治疗对胃癌患者记忆T细胞的影响术后1个月时，两组患者的外周血中CD4+TCM比例差异有统计学意义，免疫治疗组47.86%±11.77%，对照组60.00%±11.05% (P=0.006)。免疫治疗组CD8+TCM比例较对照组显著降低，对照组31.59%± 9.29%，免疫治疗组24.26%±7.71% (P=0.025) (图1)。而免疫治疗组CD8+TEM比例较对照组显著升高，对照组20.00%±8.43%，免疫治疗组29.93%± 12.40%(P=0.013)。见图2。

图 1 两组胃癌患者CD4+TCM(CD4+CD45RO+CD62L+)和CD8+TCM(CD8+CD45RO+CD62L+)比较Fig. 1 Percentage of CD4+TCMand CD8+TCMin gastric cancer patients with or without treatment

图 2 两组胃癌患者CD4+TEM(CD4+CD45RO+CD62L-)和CD8+TEM(CD8+CD45RO+CD62L-)比较Fig. 2 Percentage of CD4+TEMand CD8+TEMin gastric cancer patients with or without treatment

讨 论

新兴的免疫治疗已经成为抗肿瘤的第四大手段。免疫细胞是抗肿瘤免疫的重要组成部分，其中记忆性T细胞是体内持久存在的抗肿瘤组分，按照其不同的功能分为中央型记忆细胞TCM和效应型记忆细胞TEM[8]。TCM维持免疫记忆，在机体荷瘤或肿瘤转移状态下发挥免疫保护作用[9-10]，高表达CD45RO和CD62L，主要分布于淋巴结等次级淋巴器官等，而TEM低表达或不表达CCR7和CD62L，可以表达黏附分子和趋化因子受体，执行快速的效应功能，主要分布在免疫反应局部[11-12]，二者在抗肿瘤免疫都有重要的作用，但TCM相比TEM更有优势[13-15]。

本研究分析了晚期胃癌患者外周血记忆性T细胞的分布，发现胃癌患者外周血中中央型记忆性T细胞相对较少，而效应型记忆性T细胞比例增加，呈现典型的T细胞耗竭状态[16]，即中央型记忆细胞向效应型记忆细胞转化，缺乏功能性T细胞。虽然效应型记忆性T细胞比例增加，但是缺乏辅助性T细胞，无法发挥有效的抗肿瘤作用[17]。TCM和TEM可以作为评估胃癌患者免疫状态的有效指标，用于解释肿瘤治疗效果不佳的内在免疫机制，也可以评估各种治疗方式，进而指导肿瘤治疗方案的制订，实现肿瘤的个性化治疗。

基于T细胞的过继免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要手段，本研究中采用的DC和T细胞多细胞联合免疫治疗，将大量优质的肿瘤抗原致敏的T细胞(TCM＞60%)回输体内，及时补充肿瘤患者体内TCM细胞，有效纠正胃癌患者术后免疫损伤状态及T细胞耗竭状态。

胃癌患者免疫状态呈动态变化，以TCM和TEM为观察指标，动态监测抗肿瘤特异性免疫状态的变化，分析各种治疗手段对免疫状态的影响，探索建立优化、高效、个性化的抗肿瘤联合治疗方案，值得进一步研究。

1 Lee JH， Kim KM， Cheong JH， et al. Current management and future strategies of gastric cancer［J］. Yonsei Med J， 2012， 53（2）：248-257.

2 Iwauchi T， Tanaka H， Yamazoe S， et al. Identification of HLAA*2402-restricted epitope peptide derived from ERas oncogene expressed in human scirrhous gastric cancer［J］. Cancer Sci， 2011，102（4）： 683-689.

3 陈杨，王艳荣，张权，等．晚期胃癌患者其肿瘤相关性贫血与预后的关系［J］.解放军医学院学报，2015，36（4）：351-354.

4 刘利利，韩颖，路长宇，等．胃癌术后患者预后相关因素分析［J］.军医进修学院学报，2011，32（6）：584-587．

5 Perret R， Ronchese F. Memory T cells in cancer immunotherapy：which CD8 T-cell population provides the best protection against tumours?［J］. Tissue Antigens， 2008， 72（3）： 187-194.

6 Sallusto F， Lenig D， Förster R， et al. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions［J］. Nature， 1999， 401（6754）： 708-712.

7 Klebanoff CA， Acquavella N， Yu Z， et al. Therapeutic cancer vaccines： are we there yet?［J］. Immunol Rev， 2011， 239（1）：27-44.

8 Ludewig B， Oehen S， Barchiesi F， et al. Protective antiviral cytotoxic T cell memory is most efficiently maintained by restimulation via dendritic cells［J］. J Immunol， 1999， 163（4）： 1839-1844.

9 Wherry EJ， Teichgräber V， Becker TC， et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets［J］. Nat Immunol， 2003， 4（3）： 225-234.

10 Van Panhuys N， Perret R， Prout M， et al. Effector lymphoid tissue and its crucial role in protective immunity［J］. Trends Immunol，2005， 26（5）： 242-247.

11 Weninger W， Crowley MA， Manjunath N， et al. Migratory properties of naive， effector， and memory CD8（+） T cells［J］. J Exp Med，2001， 194（7）： 953-966.

12 Klebanoff CA， Gattinoni L， Torabi-Parizi P， et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2005， 102（27）： 9571-9576.

13 Klebanoff CA， Gattinoni L， Restifo NP. CD8（+） T-cell memory in tumor immunology and immunotherapy［J］. Immunol Rev， 2006，211： 214-224.

14 Lee HE， Chae SW， Lee YJ， et al. Prognostic implications of type and density of tumour-infiltrating lymphocytes in gastric cancer［J］. Br J Cancer， 2008， 99（10）： 1704-1711.

15 Enomoto K， Sho M， Wakatsuki K， et al. Prognostic importance of tumour-infiltrating memory T cells in oesophageal squamous cell carcinoma［J］. Clin Exp Immunol， 2012， 168（2）： 186-191.

16 Chen IH， Lai YL， Wu CL， et al. Immune impairment in patients with terminal cancers： influence of cancer treatments and cytomegalovirus infection［J］. Cancer Immunol Immunother， 2010， 59（2）：323-334.

17 Devita VT， Rosenberg SA. Two hundred years of cancer research［J］. N Engl J Med， 2012， 366（23）： 2207-2214.

Effects of postoperative immunocytes therapy for memory T cell subsets in patients with advanced gastric cancer

LI Zexue, ZHANG Lan, LI Peiyu
General Surgery Institute, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China Corresponding author: LI Peiyu． Email: lipeiyu6301@163．com

ObjectiveTo explore the effects of immunotherapy on immunological memory in patients with advanced gastric cancer．MethodsTwo hundred and fifty-three patients with advanced gastric cancer who underwent radical surgery in our hospital from October 2013 to February 2015 were enrolled in this study, and they were randomly divided into immunotherapy group (n=72) and control group (n=181) according to whether they had undergone immunotherapy, including dendritic cells (DC) and cytotoxic T cell (CTL)． Percentage of CD4+TCM(CD4+CD45RO+CD62L+), CD8+TCM(CD8+CD45RO+CD62L+), CD4+TEM(CD4+CD45RO+CD62L-) and CD8+TEM(CD8+CD45RO+CD62L-) in peripheral blood was evaluated to analyze immune memory characteristics of advanced gastric cancer patients, furthermore, influence of immunotherapy to immune memory was also analyzed．ResultsTCMaccounted for most of the CD4+T cells (54．52%±12．76%) while TEMin CD8+T cells accounted for (24．49%±11．39%)． Compared with control group, percentage of CD4+TCMand CD8+TCMin patients treated with immunotherapy decreased significantly (CD4+TCM: immunotherapy, 47．86%±11．77%, control, 60．00%±11．05%, P=0．006; CD8+TCM: immunotherapy, 24．26±7．71%, control, 31．59±9．29%, P=0．025), however, CD8+TEMincreased significantly (control, 20．00±8．43%, immunotherapy, 29．93±12．40%, P=0．013)．ConclusionMemory T cells can effectively evaluate the immune status of advanced gastric cancer, and immunotherapy can be effective in restoring immune depletion status of patients with advanced gastric cancer．

gastric cancer; T-lymphocyte subset; memory T cells; immunotherapy

R 392.9；R 730.3

A

2095-5227(2015)12-1169-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.002

时间：2015-10-20 10:29:18

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20151020.1029.004.html

2015-08-04

国家自然科学基金面上项目(81172891)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81172891)作者简介：李则学，女，学士，主管技师。研究方向：晚期肿瘤的免疫治疗。Email: lizx301@sina.com

李沛雨，男，主任医师，硕士生导师。Email: lipeiyu6301 @163.com