慢性HBV 感染者HBV 前C 区/基本核心启动子区基因突变与临床应用

湖北省中医院检验科（湖北 武汉，430074）

自1989年Carman［1］首次发现HBV前C 区1896 位点的变异可形成HBeAg（－）的CHB之后，Okamoto等［2］研究发现BCP区变异也可形成HBeAg（－）CHB。国内外对PreC 区/BCP 区变异的分子结构、生物学改变及对疾病的影响等方面进行了一系列研究［3，4］。近年来，HBV PreC 区/BCP 区变异研究也出现新的进展［5］，为了解慢性HBV 感染者HBV PreC 区变异与HBV复制关系，我们对慢性HBV感染者进行研究，探讨其HBV PreC区/BCP 区基因突变与其病程进展的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 我院2010年10月至2013年6月住院患者。其中AsC组63例（男42例，年龄28～68岁；女21例，年龄24～65岁）；CHB 组82例（男68例，年龄32～71岁；女14例，年龄25～68岁）；CHB-LC组20例（男15例，年龄45～76岁；女5例，年龄46～67岁）。所有病例诊断均符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准［5］，此前受试者均未核苷类药物、干扰素抗病毒和免疫调节治疗，排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及酒精、药物和自身免疫性肝病。

1.2 方法

1.2.1 检测项目及试剂 ①血生化检测：各观察组患者均检测血清AST、ALT、TP、Alb、A/G 比值、AFP 和TBA（总胆汁酸）。由宁波美康科技有限公司提供相应试剂盒。仪器为美国产雅培C-8000 全自动生化分析仪。②外周血清HBV DNA 含量的测定：收集患者血清，－70℃冻存至检。采用荧光定量PCR 法（FQ-PCR）检测患者血清HBV DNA含量，使用上海宏石全自动基因扩增仪，试剂盒由武汉百泰基因有限公司生产，试剂盒的最低检出限度为500 IU/ml，线性范围5.0×102～1.0×108IU/ml。③HBeAg 检测：用于评价HBV PreC 区/BCP 区基因突变在临床上的应用价值。HBeAg 检测试剂盒由北京万泰药业股份有限公司生产。④HBV PreC 区/BCP 区基因突变：采用FQ-PCR 法检测患者血清HBV PreC 区1896 位点突变和BCP 区1762／1764 双位点突变。试剂为武汉百泰基因有限公司生产。仪器为上海宏基因扩增仪。

1.2.2 统计学方法 数据采用SPSS 15.0 统计软件包进行分析处理，计量资料组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用2检验。

2 结果

2.1 3组患者血生化检测结果 见表1。由表1可见，与AsC组比较：CHB 组、CHB-LC 组患者血清ALT、AST、AFP、TBA 水平升高，差异有显著性意义（P<0.01），呈显著正相关；而TP、Alb、A/G 水平降低，差异有显著性意义（P<0.05），呈负相关。

表1 3组患者血生化指标检测结果比较（）

表1 3组患者血生化指标检测结果比较（）

与AsC 组比较，▲ P<0.05，▲▲P<0.01

2.2 3 组患者外周血清HBVDNA 含量和HBeAg 定性检测结果 见表2。由表2 可看出，HBeAg（－）可出现在慢性HBV 感染的不同病程，HBeAg（－）患者存在病毒复制。

表2 3 组患者HBV DNA 和HBeAg 检测结果

2.3 HBV PreC 区/BCP 区基因突变检测结果

2.3.1 HBeAg（+）组与HBeAg（－）组BCP 区与PreC 区突变分析 见表3。

表3 HBeAg（+）组HBeAg（－）组中BCP 区1762+1764 和PreC 区1896 突变分布［n(%)］

由表3 可见，HBeAg（+）组样本中，BCP区的突变率均高于PreC区突变率，差异有显著性意义（2=11.14，P<0.001）；HBeAg（－）组样本中，BCP 区的突变率均高于PreC 区突变率，差异有显著性意义（2=37.8，P<0.001）。

2.3.2 慢性HBV 感染不同临床类型患者PreC 区/BCP 区变异的结果 见表4。

表4 HBV Pre C 区/BCP 区变异与不同临床类型感染者的关系［n(%)］

由表4 可见，AsC 组、CHB 组、CHB-LD 组PreC 区1896、BCP 区1762/1764 变异率依次升高。与AsC 组比较：CHB 组PreC 区l896、BCP 区1762/1764 变异率升高，差异有显著性意义，P<0.05；而CHB-LC 组差异有非常显著性意义，P<0.01。

3 讨论

HBV 属嗜肝DNA病毒，其基因组长约3.2 kb，为部分双链环状DNA。HBV基因组主要包括4个开放读码框（ORF）分别位于S 区、C 区、P 区、X 区。PreC 区及C区位于同一个ORF 内，它们编码两种转录：前基因组RNA（pgRNA）和前C 区mRNA。HBV Pre C 区编码前C 信号肽，引导HBeAg 前体至内质网，通过细胞分泌器加工处理后形成成熟的HBeAg 从肝细胞分泌出去；1862 位点G—T 的置换导致病毒前核心蛋白氨基酸密码子的改变，变为终止密码子，从而阻断了HBeAg 的产生［6］。BCP是HBV复制的关键性调控因子，调控HBV 前C 基因组mRNA和前基因组mRNA转录；BCP 区的双突变（1762，1764）可使3’端茎环结构发生改变，稳定性增强，促进病毒转录的发生和复制［7］，因此BCP 区的变异被视为影响病毒复制、HBeAg 表达的主要因素之一［8］。同時BCP 中的双突变可能与活动性肝炎、肝硬化（LC）、原发性肝癌（HCC）相关［9］。

慢性HBV感染者病情轻重是由宿主和病毒两方面所决定，许多研究都显示C 基因变异与肝炎活动及严重性有关［10］。目前认为，有PreC 区变异的抗-HBe 阳性进展性肝炎（atypical type），这类患者HBeAg（－），HBVDNA（+），多有PreC区终止码变异。当HBV PreC 区1896 G→A 变异后，使末端产生翻译终止密码子TAG，导致HBeAg 前体蛋白的合成中断，造成HBeAg 减少或消失，但病毒本身复制不受影响。BCP 区的1762 位A→T 与1764 位G→A 双变异可能引起严重慢性肝脏疾病［11］。

国内外学者在研究HBV Pre C 区/BCP 区基因突变多采用患者血清HBV DNA 提取、纯化、测序、巢式PCR 扩增、限制性基因多态性片段确定基因位点突变，由于操作繁琐，难于在临床上推广应用。我们采用武汉百泰基因有限公司生产的HBV Pre C 区1896 位点基因突变、BCP 区1762/1764 位点基因突变试剂盒，简便、快速、准确应用于临床。我们对慢性HBV 感染者中AsC 63例、CHB 82例、CHB-LC 20例进行分析，血清生化指标在慢性HBV 感染者病程进展中呈现相关性。其中ALT、AST、AFP、TBA水平升高，差异有显著性意义（P<0.01），呈显著正相关；而TP、Alb、A/G水平降低，差异有显著性意义（P<0.05），呈负相关。与国內外报道相符。

AsC 组、CHB 组、CHB-LC 组HBV DNA 含量以及HBeAg检测结果及HBeAg（+）组样本中，BCP区的突变率均高于PreC区突变率，差异有显著性意义（P<0.05）；HBeAg（－）组样本中，BCP 区的突变率均高于PreC 区突变率，差异有非常显著性意义（P<0.01）。提示HBeAg（－）慢性HBV 感染患者需要谨防HBV 复制的危险性。

PreC 区、BCP 区变异在AsC 组、CHB 组、CHB-LC 组发生率依次增高，不仅提示PreC区、BCP区变异可以预测慢性HBV感染者病情的发生发展程度，还可能出现肝脏恶变的可能性［12］。

随着对HBV 基因型研究的深入，人们发现其基因型与基因变异之间似乎存在一定的相关性。例如A、F 基因型的HBV不易发生Pre C 区1896 突变，而其他基因型该位点的突变率较高。一些学者研究认为B 基因型HBV 的Pre C 区1896 位点较C 基因型更容易发生G→A 的突变，C 基因型感染者BCP 区双突变率较B 基因型感染者高。即BCP 区突变率高与C 基因型分布多有关［13］。尽管近年来对HBV PreC 区、BCP 区基因变异的研究已经较为广泛和深入，但HBV S 区、C 区、P 区、X 区也会出现基因突变，会影响慢性HBV感染者人群病程的变化；不同种族对基因突变的易感性也不同；患者自身免疫力，生存环境也会影响此类患者的病程。要对我国慢性HBV 感染人群监控，值得全社会去共同关心［14］。

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