甘草抗肝窦内皮细胞缺氧损伤的活性成分筛选*

沈 丽 陶艳艳 赵志敏，2 刘洪亮 刘成海，2，3△

1.上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所（上海，201203）2.上海市中医临床重点实验室 3.上海高校中医内科学E-研究院

甘草是豆科甘草属多年生草本植物甘草的根及根茎［1］，甘草性平，味甘，有补脾益气、清热解毒、止咳祛痰、缓急定痛、调和诸药等功效［2］，其有效成分具有保肝作用。肝窦内皮细胞（SEC）是构成肝窦的主要细胞，肝窦内皮细胞因缺血、缺氧受损时，可出现肿胀甚至破坏，使肝窦变窄、肝细胞血流供应减少，从而诱发或加重肝细胞损伤。缺血和缺氧常常是相互伴随的，各种研究表明显示，二氯化钴（CoCl2）是已经被广泛应用的模拟缺氧环境的化学试剂，能够产生与缺血、缺氧相似的反应［3］。SK-HEP-1 细胞株［4］是无限增殖的人肝窦内皮细胞株，具备肝窦内皮细胞的两大关键特点：一是窗孔结构，二是细胞内吞作用（SEC关键功能特点），因而，SK-HEP-1 细胞是我们进行中药体外活性物质筛选的理想肝窦内皮细胞载体。本研究采用CoCl2诱导SK-HEP-1 细胞株缺氧模型，筛选抗肝窦内皮细胞缺氧损伤的甘草活性成分。

1 材料与方法

1.1 药物 甘草酸单铵盐、甘草酸二铵盐、异甘草素、甘草次酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷，由上海融禾医药科技发展有限公司分离、提取、鉴定，纯度＞98%。

1.3 试剂 六水合氯化钴（CoCl2·6H2O，Cat#080M0101V），购自Sigma 公司。Dimethyl sulfoxide（DMSO，Cat#0231），购自Amresco 公司。MEM 培养基（Minimum Eagle’s Medium，Cat#41500-067）、胎牛血清（FBS，Cat#10099）购自美国Gibco公司。CCK8（cell counting kit-8，Cat#C0038）、DAPI 细胞核染色液（2-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，Cat#C0038）、DAF-FMDA（NO 荧光探针，Cat#S0019）、一氧化氮合酶（NOS，Cat#S0025）、活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，Cat# S0033），购自碧云天生物技术研究所；EdU 细胞增殖试剂盒（Cell-LightTMEdU DNA Cell Proliferation Kit，Cat#C10310），购自广州锐博生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 SK-HEP-1 细胞，以10%FBS/MEM 培养液培养，每3～4 天传代1次。

1.4.2 药物配制 ①CoCl2·6H2O，无菌超纯水溶解，贮存液浓度为 2mol/L。②甘草各单体成分溶解于二甲基亚砜（DMSO），贮存浓度为100 mmol/L。

1.4.3 氯化钴缺氧损伤模型 SK-HEP-1 细胞悬液以7×107/L按照每孔100 l 接种于96 孔板，待细胞培养融合成亚单层，弃培养液。CoCl2以10%FBS/MEM稀释，工作浓度为12.5～1600 mol/L 添加至SK-HEP-1 细胞，同时设10% FBS/MEM 培养液作为对照，分别孵育6h、12h、24h、48h、72h。弃CoCl2孵育液，添加CCK8 工作液，100 l/孔，再孵育2h，A450 测各孔吸光度。

1.4.4 药物添加 SK-HEP-1 细胞长至亚单层，分空白对照组（Normal）、CoCl2800 mol/L 组（Model）、甘草各单体成分（2～3个浓度）组、同时设相同浓度DMSO作为对照，培养箱孵育24h，观察不同浓度甘草单体对CoCl2诱导肝窦内皮细胞缺氧损伤的防护作用。

1.4.5 EdU 掺入法 参考文献［5］步骤，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader 采集图像，Cellomics Cell Health Profiling Bio-Application Software 对图像进行分析。

1.4.6 细胞免疫荧光染色DAF-FM DA（NO荧光探针）、活性氧（ROS）检测与一氧化碳合成酶（NOS）检测，分别参考文献［6，7］按试剂盒说明书方法，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader 采集图像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplication Software对图像进行分析。

1.5 统计学方法 所有数据均采用SPSS15.0 软件进行统计分析，计量资料用表示，符合正态性和方差齐性的数据用单因素方差分析，不符合正态性或方差齐性的数据用非参数检验。

2 结果

2.1 CoCl2诱导SK-HEP-1 细胞缺氧损伤模型建立 分别以含12.5～1600 mol/L CoCl2的培养液孵育SK-HEP-1 细胞6～72h，CCK8 检测细胞活力发现，800 mol/L CoCl2作用24h，对SKHEP-1 细胞活力抑制率达到50%（见图1A）。进一步检测SKHEP-1 细胞内活性氧水平发现，与空白对照组相比，800 mol/L CoCl2作用24h后SK-HEP-1细胞内活性氧水平最高（见图1B）。CCK8 法与细胞内活性氧检测结果提示，800 mol/L CoCl2作用24h 能成功诱导SK-HEP-1 细胞缺氧损伤模型。

图1 A CoCl2对SK-HEP-1 细胞活力的影响

图1 B CoCl2诱导SK-HEP-1 细胞活性氧荧光强度半定量分析（与Normal 相比，## P<0.05）

2.2 甘草成分对SK-HEP-1 细胞活力的影响 见表1。

表1 甘草各成分对SK-HEP-1 细胞活力的影响

基于前期甘草各单体对SK-HEP-1 细胞毒性实验结果，分别选择异甘草素（0.625、1.25、2.5 mol/L）、甘草苷（20、40、80 mol/L）、甘草素（20、40、80 mol/L）、甘草酸二铵盐（20、40、80 mol/L）、甘草酸单铵盐（20、40、80 mol/L）、异甘草苷（20、40、80 mol/L）、甘草次酸（1.25、2.5 mol/L）与CoCl2诱导过氧化损伤的SK-HEP-1 细胞孵育24h，CCK8 检测结果提示（见表1），异甘草素、甘草酸二铵盐能显著改善CoCl2诱导缺氧损伤SKHEP-1 细胞活力抑制作用；甘草苷、甘草素、甘草酸单铵盐与异甘草苷对CoCl2诱导缺氧损伤SK-HEP-1 细胞活力抑制无明显改善；甘草次酸对CoCl2诱导缺氧损伤SK-HEP-1 细胞活力有明显抑制作用。进一步检测SK-HEP-1 细胞内活性氧水平发现，与空白对照组相比，800 mol/L CoCl2作用24h后SK-HEP-1细胞内活性氧水平明显升高，不同浓度异甘草素、甘草酸二铵盐明显降低CoCl2诱导细胞内活性氧水平（见图2 及插页图3）。上述结果提示，甘草中7个单体成分（异甘草素、甘草苷、甘草素、甘草酸二铵盐、甘草酸单铵盐、异甘草苷、甘草次酸、）中，异甘草素与甘草酸二铵盐对CoCl2诱导SK-HEP-1 细胞缺氧损伤有明显防护作用。

2.3 异甘草素与甘草酸二铵盐对SK-HEP-1 细胞增殖的影响（见插页图4）。EdU法检测结果提示，与空白对照组相比，800 mol/L CoCl2显著抑制SK-HEP-1 细胞增殖，0.625 M、1.25 M、2.5 M异甘草素以及20 M、40 M、80 M甘草酸二铵盐可拮抗CoCl2引起的SK-HEP-1 细胞增殖降低。

图2 异甘草素与甘草酸二铵盐对CoCl2诱导SK-HEP-1 细胞内活性氧表达的影响（荧光强度半定量分析，与Normal 相比，## P<0.05；与Model比较，** P<0.05）

2.4 异甘草素与甘草酸二铵盐对SK-HEP-1 细胞内一氧化氮（NO）含量的影响 见图5。实验结果显示，与空白对照组相比，CoCl2诱导过氧化损伤SK-HEP-1 细胞NO 含量降低，0.625 M、1.25 M、2.5 M 异甘草素以及20 M、40 M、80 M 甘草酸二铵盐对CoCl2诱导的过氧化损伤SK-HEP-1 细胞内NO含量明显增加。

图5 异甘草素与甘草酸二铵盐对SK-HEP-1 细胞内（NO）含量的影响(与Normal 相比，## P<0.01；与Model 相比，** P<0.05)

2.5 异甘草素与甘草酸二铵盐对SK-HEP-1 细胞NOS活性的影响 见图6。

图6 异甘草素与甘草酸二铵盐对SK-HEP-1 细胞NOS 活性的影响(与Normal 相比，## P<0.01；与Model 相比，** P<0.05)

实验结果显示，与空白对照组相比，CoCl2诱导过氧化损伤SK-HEP-1 细胞NOS 活性降低，0.625 M、1.25 M、2.5 M 异甘草素以及20 M、40 M、80 M甘草酸二铵盐明显升高CoCl2诱导的过氧化损伤SK-HEP-1 细胞内NOS 活性。

3 讨论

CoCl2是一种化学性低氧模拟剂，在不同的细胞能模拟低氧/缺氧性损伤，表现为促进活性氧（ROS）生成，降低线粒体膜电位，并引起细胞毒性和细胞凋亡。CoCl2模拟缺氧是国际上比较常用的模拟缺氧方法，钴离子能竞争氧感受器-血红蛋白卟啉环中的铁离子，抑制氧合血红蛋白的形成而丧失与氧结合的能力，诱发一系列类似缺氧反应，从而模拟缺氧状态［6］。SEC是构成肝窦壁的主要细胞，几乎参与肝脏所有的生理、病理过程，SEC 在肝脏损伤过程中的作用主要表现在两个方面：一方面，SEC 本身受到损害，并因此加重肝脏损伤程度；另一方面，SEC 又可激活并释放出某些细胞因子去调节或损伤肝细胞。

本研究以人肝窦内皮细胞株SK-HEP-1为对象，建立CoCl2诱导的缺氧模型。结果显示，经CoCl2处理的SK-HEP-1 细胞存活率明显下降，800 mol/L CoCl2作用24 小时，对SK-HEP-1细胞活力抑制率达到50%；进一步检测SK-HEP-1 细胞内ROS水平发现，与空白对照组相比，随着CoCl2浓度增加、作用时间延长，细胞存活率明显下降、细胞内ROS 含量表达随CoCl2刺激剂量的增加而增加，800 mol/L CoCl2作用24h 后SK-HEP-1细胞内ROS 水平最高，说明800 mol/L CoCl2作用24h 成功建立了CoCl2模拟缺氧模型。

一氧化氮合酶（NOS）是合成一氧化氮（NO）的关键酶，NOS 家族主要通过催化L-精氨酸与氧分子结合生成NO。目前，已有大量的证据表明NO在多种原因引起的肝损伤和肝纤维化中起重要作用［7，8］。本研究用氯化钴模拟SK-HEP-1 细胞缺氧，采用药物高内涵筛选分析（HCS）［9，10］测定细胞内NOS、NO等水平以此评估细胞缺氧程度，结果提示，800 mol/L CoCl2作用24h 诱导SK-HEP-1 细胞过氧化损伤模型中细胞内NOS活性与NO含量升高。本研究选择甘草成分异甘草素、甘草苷、甘草素、甘草酸二铵盐、甘草酸单铵盐、异甘草苷、甘草次酸，进行干预，结果发现异甘草素与甘草酸二铵盐对CoCl2诱导SKHEP-1 细胞活力抑制有明显改善作用；同时发现，异甘草素与甘草酸二铵盐明显促进对CoCl2诱导SK-HEP-1 过氧化损伤细胞增殖；细胞免疫荧光染色提示，异甘草素与甘草酸二铵盐可显著改善CoCl2诱导的SK-HEP-1 细胞NO 含量及NOS 活性，抑制ROS 含量，具有一定的剂量依赖性。

肝窦内皮细胞作为肝中一种具有诸多功能的间质细胞，在急、慢性肝损伤的发生、发展中起着非常重要的作用。本研究筛选出甘草单体成分异甘草素与甘草酸二铵盐对CoCl2诱导的SK-HEP-1 细胞缺氧损伤有显著防护作用，同时显著改善CoCl2诱导的SK-HEP-1 细胞NO 含量及NOS 活性，抑制ROS含量，但其具体作用机制仍有待于进一步研究。

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