衣康酸发酵过程工艺研究

徐建春，孙慧彬，于水见

（青岛琅琊台集团股份有限公司，山东青岛 266400）

衣康酸发酵过程工艺研究

徐建春，孙慧彬，于水见

（青岛琅琊台集团股份有限公司，山东青岛 266400）

研究了不同因素对发酵法生产衣康酸的影响，确定了衣康酸发酵生产的最佳温度为36～37°C和最佳初始pH为3.2～3.6。研究辅助有机氮源对衣康酸发酵生产的影响，从生产实际和经济方面考虑，采用麦麸作为辅助氮源比较合适。

衣康酸；氮源；温度；pH

衣康酸（Itaconic acid）学名为甲叉琥珀酸，亚甲基丁二酸，是一种不饱和二元有机酸（分子式：C5H6O4；分子量：130.1；熔点：165～169°C；化学文摘号：97-65-4。溶于水、乙醇和丙酮等溶剂，微溶于氯仿、苯和乙醚）。因衣康酸中含不饱和双键，使其化学性质很活泼，可进行自身间的聚合，能与其他单体如丙烯腈等聚合，也能进行各种反应，如加成反应、酯化反应和聚合反应等，是重要的生产原料。

衣康酸生产方法有发酵法和化学合成法。生物发酵法的生产工艺和生产条件容易控制、工艺条件温和，且原料主要是玉米淀粉水解糖，属于可再生的资源，而且原料易得，来源丰富，生产成本受其影响较小，相对较稳定，在经济上占有一定优势。因此，目前国际国内大多都采用生物发酵的方法。

微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，还需要有合适的环境条件即发酵工艺加以配合，才能使其生产能力充分表现出来。因此必须研究生产菌种的最佳发酵工艺条件，如营养要求、培养温度、pH条件和氧的供需等。自从人们发现土曲霉（Aspergillus terreus）可以利用葡萄糖转化生产衣康酸后，便开始致力于研究发酵法生产衣康酸的工艺技术，衣康酸的生产技术水平也不断提高，其转化率由一开始的30%提高到62%以上。后来，人们又对不同形式的衣康酸发酵进行了研究，如深层发酵工艺、表面发酵工艺、半连续发酵工艺等。在衣康酸原料利用方面，研究了将纤维素水解糖、蔗糖和淀粉作为原料发酵生产衣康酸的可行性。同时，衣康酸发酵与所有的好氧发酵一样，还受到很多因素的影响，如pH、温度、溶解氧、搅拌转速、微量元素、碳氮源等，对影响衣康酸发酵因素的研究一直是人们关注的重点。1997年，贾士儒等人[1]研究报道了气升式罐发酵衣康酸的情况以及氧的供给对土曲霉IFO-6365菌株衣康酸发酵的影响；1995年，Gyamerah等人[2]研究报道了发酵培养基的组成对土曲霉（Asp.terreus NRRL1960）菌株生长形态及产酸情况的影响。

本研究以玉米淀粉水解糖为原料，对高产菌株土曲霉KHT1（Asp.terreus KHT1）衣康酸发酵工艺进行了研究，主要探索温度、装液量、初始PH、辅助有机氮源对发酵产酸的影响。

1 材料与方法

1.1 菌种

实验室保藏菌株：土曲霉KHT1（Asp.terreus KHT1）。

1.2 原料、仪器、设备

表1 试剂及设备

1.3 培养基

种子麸曲培养基：1000 mL三角瓶装，干麸皮20～30 g，加水比为1∶0.5～0.8，120°C条件下灭菌30 min。待麸皮冷却后，在无菌操作台上接种，然后转入培养间，在33°C条件下培养7 d，种子成熟冷藏待用。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖123，NH4NO33.9，MgSO4·7H2O 0.4～0.6，FeSO4·7H2O 0.04，ZnSO4· 7H2O 0.02，pH为3.6～4.0。

1.4 玉米淀粉水解糖的制备

淀粉与水按比例1∶1.0～1.5（w/v）混合，然后调pH至6.0，按12 U/g干淀粉（以纯淀粉计）的量加入高温淀粉酶，然后液化、糖化、压滤制得糖液备用。

1.5 发酵实验

在50 L发酵罐中进行发酵实验，按发酵培养基配方组成将所需的原辅料投加到发酵罐中，罐的填充系数控制在50%～60%。主要考查不同的发酵温度对发酵产酸的影响，更换不同的辅助有机氮源，观察发酵产酸的变化情况。

1.6 分析方法

1.6.1 总酸的测定

酸碱滴定法[3]。

N1—标准NaOH摩尔浓度（mol/L）；

V1—消耗NaOH溶液毫升数（mL）；

65.05—1 /2衣康酸摩尔量（g）；

1—吸取发酵液l mL。

1.6.2 还原糖的测定

斐林试剂法。

S-残糖含量（10-2g/mL）；

V0—空白滴定消耗葡萄糖标液毫升数（mL）；

V1—正滴定消耗葡萄糖标液毫升数（mL）；

0.1—葡萄糖标准溶液的浓度（10-2g/mL）；

0.2—吸取试样的毫升数（mL）。

1.6.3 糖酸转化率的计算

1.6.4 菌体量的测定

血球计数板法。

2 实验结果和讨论

2.1 温度对Asp.terreus KHT1发酵产酸的影响

温度是影响有机体生长繁殖最重要的因素之一，因为任何生物化学的酶促反应都是直接与温度变化有关的。对微生物发酵来说，温度的影响是多方面的，可以影响各种发酵条件，最终影响微生物的生长和产物的形成。对微生物细胞的生长来说，随着温度的上升，酶促反应速度加快，呼吸加强加快，导致细胞的生长繁殖加快，菌体衰老提前，发酵周期缩短，这对发酵生产是不利的，最终导致产量下降。在适合温度下，菌体将发挥其最大的能力，以最高的转化率生成产物。温度还可以通过改变发酵液的物理性质间接的影响菌体的生物合成，如温度可以影响基质和氧在发酵液中溶解和传递速率，菌对某些基质的分解吸收速率，因此，最适温度的确定要考虑多种因素的影响。50 L发酵罐中，温度对发酵结果的影响见表2。

从表2的数据可以看出，发酵温度在36～37°C时发酵产酸结果最好，而且菌体生长繁殖速度正常，转化率也较高。从发酵过程来看，在36～37°C温度间进行产衣康酸的发酵，菌体生长速度比较均匀，发酵24 h后，发酵液中菌体开始分叉生长，同时就有衣康酸的产生。在较低的温度条件下发酵，发酵液颜色浅，菌体浓度低，产酸低。在较高温度下，料液颜色相对变深，由原来的微黄色变为微红色，产酸也很低。

表2 温度对Asp.terreus KHT1发酵的影响

2.2 装液量对发酵的影响

图1 装液量对发酵的影响

实验结果表明，500 mL三角瓶中装液量在50～60 mL之间时，产酸最高。低于50 mL时，因为种子萌芽阶段水的蒸发，造成培养基中成分的比例变化较大，水的活度下降，影响了营养物的吸收代谢。装液量高于60 mL时，因为料液量大，造成溶氧不足，使发酵结果差。

2.3 初始pH值对发酵的影响

关于pH值对发酵产酸的影响早在1945年Lockwood等人[4]报道了土曲霉积累衣康酸的pH值在2.0左右；Batti等人[5]则指出衣康酸发酵的pH值对于杂酸的形成关系重大，pH高于5.0时无杂酸生成，pH低于3.0时土曲霉所产的酸有15%是杂酸，为了保证发酵产酸的纯度，必须用碱将pH维持在3.0～5.0范围内。2000年，Riscaldati等人[6]报道了pH值对土曲霉衣康酸发酵的影响，发现发酵培养基中磷的浓度降到10 mg/L以下时，菌体停止生长而进入产酸阶段。

图2 pH值对发酵产酸的影响

图2表明控制初始pH值在3.2～3.6之间，发酵的产酸会达到最高，残糖会降至最低。

2.4 辅助有机氮源对发酵影响的结果

1969年，Nowakowska-waszezu等人研究发现土曲霉在以葡萄糖为碳源，以NH4NO3、（NH4）2SO4或谷氨酸为氮源时，均不能生长和产衣康酸，添加0.1%的玉米浆，则产5%左右的衣康酸，如用0.01%的KH2PO4和Ca2+则可以达到同样的产酸水平，在含有KH2PO4和Ca2+的培养基中再添加玉米浆，反而有抑制作用。发酵试验中，控制起始糖浓度为155.0 g/L，初始pH值为3.6，分别采用玉米浆和麦麸作为辅助有机氮源，考察不同的添加量对产酸结果的影响，并综合考虑其生产实用的经济性。结果见表3。

从表3看出，用麸皮作为辅助有机氮源比用玉米浆总体来说产酸要高，而且发酵料液颜色浅。从生产实际考虑，麦麸的价格要比玉米浆便宜，而且麦麸容易保存，长时间保存不变质。

3 小结

对菌株Aspergillus terreus KHT1的发酵工艺条件和培养基做了研究，主要从发酵温度、装液量、pH值和氮源的应用对发酵产酸的影响进行了分析。发酵温度控制在36～37°C时产酸最高；500 mL摇瓶中装液量在50～60 mL时发酵结果最好，而初始pH值控制在3.2～3.6之间时，也能达到最好的产酸效果。对比了辅助有机氮源玉米浆和麦麸对发酵的影响，玉米浆用量0.24%时产酸最高，可以达到91.8 g/L，但是发酵液颜色微红色较深；麦麸的用量0.04%～0.08%时，发酵产酸都较高，在用量为0.08%时达到92.3 g/L。从生产实际和经济方面考虑，采用麦麸作为辅助氮源比较合适。

Studies on fermentative process of itaconic acid

XU Jianchun,SUN Huibin,YU Shuijian
(Qingdao Langyatai(Group)Co.,Ltd.,Qingdao 266400,China)

Effects of different factors on itaconic acid fermentation were studied.The optimal temperature and initial pH for itaconic acid fermentation were 36-37°C and 3.2-3.6,respectively. The effects of auxiliary organic nitrogen sources on itaconic acid fermentation were also studied.In the view of industrial production and economic benefits,wheat bran was selected as auxiliary nitrogen source.

itaconic acid;nitrogen source;temperature;pH

TQ921

A

1674-2214（2015）01-0019-03

2014-12-10

国家高技术研究发展计划（863计划）（SS2015AA021003）

徐建春（1973—），男，高级工程师，主要从事有机酸发酵工程研发、规划、科技项目设计，E-mail∶xjclyt@126.com.