棉籽蛋白水解液对L-赖氨酸发酵的影响

翟艳玲，常立群，徐庆阳

（1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.宁夏伊品生物科技股份有限公司，宁夏 银川 750100）

近年来，随着L-赖氨酸生产企业产量扩增，原辅料价格上升，产品利润空间逐渐缩小，因此选育高产菌株，提高赖氨酸发酵水平，降低生产成本，成了各企业抢占市场的关键手段。相对于通过诱变或者基因重组等方法定向改造生产菌株，选择优质价廉的辅料，利用工农业废弃物和下脚料“变废为宝”是企业快速、直接降低成本，提高发酵水平的普遍途径之一。

棉籽蛋白质量相对稳定、游离棉酚含量低、蛋白质含量高、利于微生物利用、价格低廉等[1]。棉籽蛋白水解液作为一种具有性价比优势的有机氮源，在欧美等国的发酵行业中得到广泛应用，可替代豆粕、酵母粉、鱼粉和玉米浆等多种有机氮源，但它在我国发酵行业的应用才刚刚起步[2-3]。本文研究了以棉籽蛋白水解液作为有机氮源，利用谷氨酸棒杆菌发酵生产赖氨酸，确定了其最佳培养基组成及发酵条件。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

1.1.1 菌种

谷氨酸棒杆菌突变株LS260，为天津科技大学代谢工程研究室保藏菌种。

1.1.2 种子培养基

葡萄糖3%，豆饼水解液0.5%，硫酸铵0.4%，碳酸钙0.5%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，pH 7.0，250 mL三角瓶中装液量为 25 mL，0.12 MPa灭菌20 min，冷却后备用。

1.1.3 发酵培养基

葡萄糖5%，硫酸铵2.0%，碳酸钙0.5%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，玉米浆0.6%，硫酸亚铁20 mg，硫酸锰20 mg，棉籽蛋白水解液适量，pH 7.0，0.12 MPa 灭菌 20 min。

1.2 主要仪器及设备

紫外分光光度计（UV754N），上海菁华科技仪器有限公司；全自动发酵罐（FUS10L），上海国强生化工程装备有限公司。

1.3 培养方法

1.3.1 种子培养

在无菌条件下使用灭菌后的生理盐水将培养好的试管斜面菌种洗下（每只斜面加入10 mL生理盐水），按 10%的接种量接种，在30°C，转速280 r/min条件下，培养12 h。

1.3.2 发酵罐发酵

4 L培养基置于10 L自动发酵罐中，通入液氨和无菌空气，在无菌条件下按10%的接种量接种，温度为 30°C，转速 280 r/min，残糖在 2%左右时流加55%的葡萄糖，全过程流加25%氨水控制pH为7.0，当产酸值不再变化并有pH上升时即为发酵终点，用酸性茚三酮显色法测定产酸量。

1.4 分析测定方法

1.4.1 赖氨酸含量检测

酸性茚三酮显色法。

1.4.2 菌种生长量检测

0.2 mL发酵液加入5 mL蒸馏水，以蒸馏水做空白对照，在波长562 nm下测定吸光度值。

1.4.3 残糖检测

费林试剂滴定法。

1.4.4 氨基氮测定

微量凯氏定氮法。

1.4.5 pH检测

酸度仪、精密pH试纸。

1.4.6 游离氨基酸检测

日本日立L-8900氨基酸分析仪。

2 结果与分析

2.1 棉籽蛋白水解液成分分析

棉籽中蛋白质含量较高，可达38%～45%，富含高蛋白质，但蛋白不利于菌体代谢，使用盐酸溶液水解蛋白质成游离氨基酸，使其利于代谢。棉籽蛋白与6 mol/L盐酸质量比为1∶2，加热升温至105°C，搅拌 20 min，静置 8 h，取上清液得棉籽蛋白水解液。利用氨基酸分析仪检测分析豆粕水解液、棉籽蛋白水解液中游离氨基酸含量。

表1 游离氨基酸成分分析

从表1中各氨基酸组成对比可见，棉籽蛋白水解液中氨基酸总量较豆粕水解液中高4.94%，尤其是谷氨酸、精氨酸和酪氨酸差异最为显著，仅蛋氨酸含量稍低，为0.05%。

2.2 棉籽蛋白水解液对菌体生长的影响

为考察棉籽蛋白水解液对赖氨酸种子培养的影响，改变种子培养基配方，由棉籽蛋白水解液代替豆粕水解液 （以原始配方豆粕水解液添加量0.5%作对照），测定种子发酵液菌体浓度，如图1。

从图1可以看出，0.1%的棉籽蛋白水解液不能满足菌体生长的需求，菌体延滞期加长，对数生长期OD增长值远低于对照组。随着棉籽蛋白水解液添加量的增加菌种浓度进一步提高，添加量达到0.3%时与对照批次菌体生长情况相当，当添加量为0.5%时，菌种对数生长提前。通过与菌体耗糖的对比，可以发现棉籽蛋白水解液促进菌体生长的作用明显，菌体耗糖速度也随着棉籽蛋白水解液使用浓度的增加而增加。

从图2可以看出，由于棉籽蛋白水解液营养丰富，微生物利用迅速，但若棉籽蛋白水解液添加量过多，菌体生长速度加快，耗糖量增加，导致培养基中营养成分快速耗尽，菌体稳定期缩短。而种子生长过快，并不利于后期发酵，容易导致发酵后期菌体衰老过快。综合考虑经济成本及发酵控制等因素，确定种子培养基中的棉籽蛋白水解液的浓度维持在0.3%较为适宜。

图1 不同添加量对菌体生长的影响

图2 不同添加量对菌体耗糖速度的影响

2.3 棉籽蛋白水解液对发酵过程的影响

为单一考察棉籽蛋白水解液对赖氨酸发酵过程的影响，种子培养基仍使用豆粕水解液的配方不变，调整发酵培养基的配方，由棉籽蛋白水解液代替豆粕水解液，以原始配方豆粕水解液添加量1.0%作为对照，测定发酵液菌体浓度及赖氨酸含量，结果见表2。

表2 棉籽蛋白水解液不同添加量对发酵产酸的影响

从表2可见，对比不同棉籽蛋白水解液添加量对赖氨酸发酵产酸的影响，初始棉籽蛋白水解液的添加量在0%～1.0%之间，赖氨酸产酸量逐步提高，添加量达到0.8%时，赖氨酸产量达到最大值257 g/L。

2.4 复合使用对发酵的影响

因棉籽蛋白水解液含有大量的有机氮源，对赖氨酸发酵非常有利，综合2.2和2.3的实验结果，在种子培养基中分别添加0.1%、0.3%的棉籽蛋白水解液，在发酵培养基中分别添加0.8%、1.0%的棉籽蛋白水解液进行多次实验，采用交叉试验，测定赖氨酸含量及糖酸转化率，结果见表3。

表3 复合使用对发酵的影响

由表3可见，在种子培养基及发酵培养基中添加不同量的棉籽蛋白水解液，赖氨酸含量均有所变化。实验批次3赖氨酸含量最高，达到268 g/L，其中种子、发酵培养基中棉籽蛋白水解液分别添加了0.3%、0.8%，较对照批次赖氨酸含量增加了19 g/L，最高转化率为69%，从而降低了生产成本，提高了赖氨酸生产的竞争力。

3 讨论

本文初步探索了赖氨酸发酵中使用棉籽蛋白水解液作为有机氮源的可行性，证明棉籽蛋白水解液的添加对赖氨酸产量有着显著地影响。确定了在种子、发酵培养基中分别添加0.3%、0.8%的棉籽蛋白水解液，赖氨酸产酸达到268 g/L，比对照批次提高了9.05%，最高转化率为69%。若在种子、发酵培养基中复合使用棉籽蛋白水解液，生产赖氨酸的成本可大大降低，为赖氨酸工业化生产带来巨大的经济效益，同时为棉籽蛋白水解液在发酵行业中的广泛应用提供了实践依据。

[1]赵贵兴．棉籽蛋白的营养特性和生产应用研究[J]．黑龙江农业科学，2002，25(4)：41-43.

[2]高振，周华，万红贵，等．棉籽蛋白在天冬氨酸转氨酶发酵制备中的应用[J]．食品与发酵工业，2005，31(2)：6-9．

[3]张延坤．棉籽蛋白的应用研究进展[J]．食品工业，1995，17(1)：51-55．