蜡样芽孢杆菌烯醇还原酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

应向贤，李国四，范雅君，胡宝军，汪 钊

（浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014）

引言

烯醇还原酶（enone/enoatereductases，EC1.6.99.1）又称老黄酶（old yellow enzyme），是一类可以利用NADH或NADPH对α,β-不饱和C=C双键进行双键加氢的氧化还原酶。烯醇还原酶可以在不对称还原C=C反应中同时引入两个手性中心，该反应是合成许多手性精细化工品的必要步骤，因此近年来受到广泛关注。烯醇还原酶通过分别转移还原态FMN中和水分子中的[H]到底物的Cβ与Cα上完成底物的反式加氢[1-2]，而以金属催化剂为媒介的化学催化以底物C=C的顺式加氢更为常见[3-4]。这种独特的反式加氢使得烯醇还原酶成为现有的化学催化C=C加氢的重要补充。现已发现烯醇还原酶能够催化多种活泼烯烃的还原，包括α,β-不饱和醛酮、硝基烯、羧酸以及他们的衍生物（酯，内酯，环胺，酸酐）[5-8]。烯醇还原酶作为生物催化剂在生物催化中的应用主要是整细胞催化法[9-12]，然而目前整细胞催化活性低，而且胞内羰基还原酶的存在降低了整细胞对α,β-不饱和羰基化合物中C=C和C=O键的化学选择性[11-12]。与整细胞催化法相比，酶法催化C=C加氢具有高活性和高立体选择性等优点，可以有效克服整细胞催化法的缺点，因而对烯醇还原酶及其酶法催化的研究越来越受瞩目[13-16]。

本研究以实验室保藏菌株Bacillus cereus WZY004为出发菌株，对其基因组中的烯醇还原酶基因进行了克隆和表达，并利用亲和层析实现了重组烯醇还原酶的分离纯化。在此基础上，研究了该重组酶的酶学性质，如最适pH、最适温度、热稳定性、底物特异性等，为其在C=C加氢上的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体

蜡样芽孢杆菌WZY004（B.cereus WZY004）为实验室保藏菌株。宿主菌大肠杆菌E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）为实验室已有资源。表达载体pEASY-E1购自于北京全式金（TransGen Biotech）生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。用于基因组提取、质粒提取、PCR产物纯化和DNA胶回收的试剂盒均购自大连TaKaRa公司。辅酶NADH购自上海申能博彩公司。

1.1.3 引物

根据已知Bacillus cereus ATCC 14579基因组中烯醇还原酶基因（AE016877.1）设计PCR扩增烯醇还原酶基因的引物为：上游引物5'-TTGATGAATTCCAAGCTTTTTTC-3'，下游引物 5'-TTATTTATTCGTATGAATTTTTCCTG-3'。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.1.4 培养基

LB培养基（g/L）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，用NaOH将pH调至7.0。固体培养基添加2.0%的琼脂。培养基于121°C下灭菌20 min。

LB/Amp培养基：灭菌后的LB培养基加入终浓度为 100 μg/mL的氨苄青霉素（Amp）。

1.2 方法

1.2.1 烯醇还原酶Bac-OYE基因的克隆

PCR扩增烯醇还原酶基因以B.cereus WZY004基因组DNA为模板，扩增条件为：94°C预变性4 min；94 °C 变性 30 s，55 °C 复性 30 s，72 °C 延伸 1 min，反应循环数为 30；72°C后延伸 10 min。扩增后的产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测并回收。纯化后的PCR产物连接到pEASY-E1表达载体上，连接产物转入50 μL Trans1-T1感受态细胞中，具体操作参照pEASY-E1 Expression Kit说明书。利用菌落PCR方法鉴定阳性克隆子，取鉴定正确的克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司测序。将测序所得的基因与GenBank中对应的基因序列进行比对分析，将含有正确片段的质粒命名为pEASY-E1-OYE。

1.2.2 重组烯醇还原酶Bac-OYE的表达和纯化

用质粒提取试剂盒从Trans1-T1菌体中提取重组质粒pEASY-E1-OYE，取10 μL将其转入200 μL E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，并涂布于LB/Amp抗性平板上37°C下培养过夜。挑取阳性菌株单菌落接种于含Amp的LB液体培养基中在30°C和200 r/min下摇瓶培养12 h，作为种子液。然后按1%接种量扩大培养接种至150 mL LB液体培养基中，在37°C和200 r/min下培养至菌液浓度（OD600）约为 0.6～0.8 时，添加诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度为0.2 mmol/L，在25°C和200 r/min下继续培养8～10 h过量表达目的蛋白。诱导完成后10000 r/min离心10 min收集菌体，超纯水清洗并重悬菌体，然后在冰浴条件下超声破碎细胞。超声破碎细胞条件为：工作时间2 s，间歇时间5 s，破碎总工作时间为40 min。细胞破碎液在4°C下12000 r/min离心10 min，收集上清；相同离心条件下重复离心3次。将收集到的上清液进行Ni-NTA亲和层析获取目的蛋白，收集到的目的蛋白经超滤浓缩脱盐后，进行SDS-PAGE检测（丙烯酰胺浓度为13.5%）并测定蛋白浓度。分装Bac-OYE纯酶保存于-20°C冰箱备用。

1.2.3 重组烯醇还原酶Bac-OYE的酶学性质研究

酶活力的测定在96微孔板中进行，标准反应体系总体积为200 μL，分别包含10 mmol/L的氧代异佛尔酮、0.4 mmol/L 的 NADH、100 μg/mL 的纯酶，50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液。反应在pH 7.5和40°C下进行，通过最终加入NADH启动反应，通过检测1 min内在340 nm下NADH吸光值的降低来确定酶活大小。NADH的摩尔消光系数为 6.22×103M-1cm-1，一个酶活力单位（U）定义为每分钟消耗1 μmol NADH所需的酶量。Bac-OYE对底物氧代异佛尔酮的动力学参数测定方法按照上述酶活性分析方法进行，其中氧代异佛尔酮的浓度范围为0.25～10 mmol/L。采用双倒数法计算重组烯醇还原酶Bac-OYE以氧代异佛尔酮为底物时的Km和Vmax。

通过测定不同pH缓冲液中Bac-OYE的酶活确定该蛋白的最适pH。采用的缓冲液分别为Tris-HCl缓冲液 （pH 7.0～9.0）和柠檬酸缓冲液（pH 4.0～7.2）。最适温度通过测定不同温度下的酶活来确定，温度范围为25～70°C，5°C为一个间隔。

为了测定重组烯醇还原酶Bac-OYE的热稳定性，一定浓度的酶溶液在不同温度下孵育120 min，每20 min取样一次，检测Bac-OYE在不同条件下的残余活力。以孵育前的酶活力为100%计算相对酶活力。

为了测定重组烯醇还原酶Bac-OYE底物特异性，在标准反应还原体系中，分别添加不同的α,β-不饱和羰基化合物作为底物，在最适反应条件下检测重组酶对不同底物的催化效果。以对氧代异佛尔酮的活力为100%，其他底物以此计算相对酶活力。

2 结果与讨论

2.1 重组烯醇还原酶Bac-OYE的表达和纯化

蜡样芽孢杆菌WZY004基因组DNA中的重组烯醇还原酶Bac-OYE基因经PCR扩增后，通过TA连接的方式连接至表达载体pEASY-E1上，构建得到重组质粒pEASY-E1-OYE。将重组质粒pEASY-E1-OYE转化入宿主菌E.coli BL21（DE3）。在IPTG诱导下，重组烯醇还原酶Bac-OYE在E.coli BL21（DE3）中以可溶蛋白形式过量表达。利用重组质粒携带的多组氨酸标签，表达的重组酶经Ni2+亲和色谱分离纯化。纯化的重组酶经SDS-PAGE检测为单一条带（图1），实现了重组蛋白的一步纯化。该重组酶分子量约为38.2 kD，与预期相符。经过酶活力和蛋白质浓度测定，计算得该重组酶的比活力为0.72 U/mg。

图1 重组烯醇还原酶Bac-OYE纯化前后的SDS-PAGE分析

2.2 酶促动力学参数测定

对不同浓度氧代异佛尔酮进行酶活力测定，根据测定结果进行双倒数曲线拟合（图2）。曲线拟合度R2=0.99411，拟合方程为y=0.54659x+0.8859，根据拟合曲线计算得到Bac-OYE对氧代异佛尔酮的Km和Vmax分别为1.83 mmol/L与1.13 U/mg。测定时发现Bac-OYE能同时利用NADH和NADPH，但更倾向于利用NADH为辅酶。以NADH为辅底物时比酶活是NADPH的1.5倍。

2.3 最适pH和最适温度

纯化后的 Bac-OYE在 pH 7.0～8.0的 Tris-HCl缓冲液中活力较高，在pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中活力达到最高 （图3）。Bac-OYE在温度30～60°C范围内酶活缓慢升高并且在60°C时达到最大，而当温度超过60°C后，酶活迅速降低，在70°C时酶完全失活（图4）。

图2 重组烯醇还原酶Bac-OYE的双倒数曲线

图3 pH对重组烯醇还原酶Bac-OYE酶活力的影响

图4 温度对重组烯醇还原酶Bac-OYE酶活力的影响

2.4 热稳定性

纯化后的Bac-OYE的热稳定性研究表明，在温度40°C和45°C孵育2 h后其活力基本保持不变。而50°C孵育1 h后酶活就迅速下降，2 h后酶活基本消失。60°C酶极不稳定，20 min后酶活损失接近50%，1 h后完全失活（图5）。

2.5重组烯醇还原酶Bac-OYE的底物特异性

图5 重组烯醇还原酶Bac-OYE的热稳定性

以α,β-不饱和醛酮及其衍生物为底物，研究了重组烯醇还原酶Bac-OYE的底物特异性。以Bac-OYE对氧代异佛尔酮的比酶活为100%，计算Bac-OYE对所有底物的相对活力（表1）。Bac-OYE对氧代异佛尔酮及其衍生物的活力相差很大，只对氧代异佛尔酮表现出活力，而对4号位没有酮基的衍生物（如异佛尔酮、4-羟基异佛尔酮、3-环己烯-1-酮）不表现活力，由此推测4号位酮基对酶活力具有重要作用。该重组酶对于直链化合物上的α,β-不饱和C=C双键均表现出活力，尤其对柠檬醛、2-甲基-2-戊烯醛和反式-2-癸烯醛表现出较高活力。对于环状化合物侧链上的α,β-不饱和C=C双键，Bac-OYE只对肉桂醛有较低活力。同时该酶对马来酰亚胺表现出较高活力而对其结构类似物马来酸酐不表现活力。此外，对α,β-不饱和醛酮的衍生物肉桂酸甲酯也有和对氧代异佛尔酮相似的活力。

表1 重组烯醇还原酶Bac-OYE的底物特异性

3 结论

本研究以实验室保藏菌株Bacillus cereus WZY004的基因组为模板，成功克隆、表达并纯化出了一种烯醇还原酶Bac-OYE。该酶可以同时利用NADH和NADPH作为辅酶，但更倾向于NADH。对Bac-OYE的底物特异性分析发现其对链状α,β-不饱和醛具有较高活力，尤其是柠檬醛、2-甲基-2-戊烯醛以及反式-2-癸烯醛。目前对于α,β-不饱和醛酮以及其衍生物的不对称还原主要集中在化学方法上，区域选择性和立体选择性不高，本研究的结果可以作为化学加氢方法的补充。

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