结肠黏膜褪黑素受体表达与肠易激综合征症状相关性研究

陈晓敏，罗 云，江 敏，吴跃龙，施月芳，桂 琴

1.上海市嘉定区安亭医院内科，上海201805;2.上海交通大学附属仁济医院嘉定分院病理科

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种常见的功能性胃肠病［1］，以反复腹痛、腹泻、便秘、腹胀等为主要表现。传统观点认为胃肠动力障碍和内脏高敏感等是引起IBS 的关键因素。近年来认为脑肠轴调节失调是主要原因［2］。褪黑素(melatonin，MT)是脑肠轴中神经内分泌激素之一，具有多种神经内分泌作用，如何通过MT 调节胃肠功能的具体机制尚不清楚，本课题通过研究MT 与IBS 的关系来探讨IBS 的发病机制，为IBS 治疗提供方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2011 年8 月-2014 年2 月上海市嘉定区安亭医院消化内科IBS 患者90 例，男51例，女39 例，年龄20 ～70 岁，平均年龄(49. 13 ±14.60)岁，诊断符合功能性胃肠病罗马Ⅲ标准［3］。入选病例排除消化道及其他器质性疾病史，无近期服药史。腹泻型IBS(IBS-D)46 例，男28 例，女18 例，平均年龄(50.89 ±14.98)岁;便秘型IBS(IBS-C)44 例，男23 例，女21 例，平均年龄(47.29 ±14.11)岁。所有患者均签署知情同意书。对照组19 名，男9 名，女10名，年龄21 ～67 岁，平均年龄(48.42 ±15.02)岁，均为同期正常体检者、健康志愿者，均有正常完整的结肠，现无任何肠道疾病症状。

1.2 主要试剂 兔抗人MR(美国Zeta 公司产品)和二步法免疫组化试剂盒(上海长嘉生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本处理和染色:所有受检者结肠镜检查前口服甘露醇500 ml+5%葡萄糖氯化钠1 000 ml 清洁肠道，然后进行结肠镜检查。所有检查者结肠镜下黏膜均正常，受检者在距肛门20 cm 处取结肠黏膜2 块，立即放入10%中性缓冲甲醛液中固定，送检病理科进行标本处理:常规脱水、石蜡固定、包埋、切片。1 块活检黏膜常规HE 染色，1 块利用特殊抗体作MR 免疫组化染色。组织学检查由同一名病理医师完成。MR 试剂为美国Zeta 公司生产的兔抗人MR 抗体。MR 免疫组化染色由嘉定区中心医院病理科协作完成。免疫组化采用二步法实验步骤:操作步骤按照试剂盒说明书进行。二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，高温高压抗原修复，3% H2O2液10 min 灭活内源性过氧化物酶，PBS 液冲洗3 次，滴加二抗(Ms/Ra-HRP)，孵育30 min，PBS 冲洗3 次，DAB 显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，透明、封片。用PBS 液代替一抗作阴性对照。

1.3.2 染色结果判断:免疫反应阳性细胞染色结果分析采用粗略计分标准，随机清点5 个高倍视野阳性细胞数取平均值。染色结果判断:MR 阳性反应颗粒呈棕黄色或棕褐色，对照片为阴性反应。MR 分布于细胞膜和细胞质内，偶见细胞核内着色。判定标准:阳性着色在黏膜表层细胞，阳性细胞总数≤1 为(-)，记1分;阳性着色在黏膜表层细胞和黏膜腺体细胞，且每个视野阳性细胞数量5 个(含5 个)以下记2 分;阳性着色在黏膜表层细胞和黏膜腺体细胞，且每个视野阳性细胞数量6 ～10 个(含10 个)记3 分;阳性着色在黏膜表层细胞和黏膜腺体细胞且每个视野阳性细胞数量在10 个以上记4 分。

1.3.3 问卷表:制定有关IBS 症状评分问卷表(IBSSESQ)［4］，包括腹痛、腹胀、排便性状、排便感觉、生活质量，上述每个症状按0 ～10 等级记分，0:无不适，10:最严重，计算总IBS 症状积分，＞20 分提示明显的肠功能异常;各项分值越大提示严重程度越大。所有IBS 患者受检前完成问卷表。

1.4 统计学分析 采用SPSS 11.5 统计软件进行分析，数据用±s 表示，IBS 组与正常对照组之间、IBS亚组间进行MR 差异性分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA);IBS 症状评分与MR 间相关性的分析采用Pearson 相关系数。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 IBS 组与正常对照组间、IBS-D 与IBS-C 组间性别构成和年龄比较，差异均无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。所有受检者结肠镜检查中均未见异常，结肠黏膜活检标本常规HE 染色组织学检查无异常。两组患者组织学检查均无显著性差异。

2.2 结肠黏膜MR 阳性细胞数量比较 对照组结肠黏膜MR 表达为2.05 ±0.78;IBS-D 组为1.41 ±0.50;IBS-C 组为2.48 ±0.63;IBS-D 组、IBS-C 组与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 MR 与IBS 症状程度相关性分析 总体IBS 组症状积分(21.89 ±2.11)与MR 表达(1.93 ±0.78)相关(P = 0. 024，r = 0. 238)。IBS-C 组症状积分(21.57 ± 2. 06)与MR 表达相关(P = 0. 012，r =0.376)。IBS-D 组症状积分(22.20 ±2.14)与MR 表达无相关性(P=0.86)。

3 讨论

本研究发现IBS 组与正常对照组间结肠黏膜MR表达有差异。IBS-C 患者MR 表达明显高于对照组，对照组MR 表达高于IBS-D 组，这与Stepień 等［5］研究一致。此外，本研究发现IBS 组症状积分与MR 表达相关。

MT 是由哺乳动物和人类的松果体分泌的一种吲哚类激素。Bubenik 等［6］首先报道褪黑激素在肠道黏膜的存在。这一观察结果后来被免疫组织化学和放射免疫分析技术证实［7］。MT 在胃肠道大量分布，它的量是血液中的100 倍，是松果体的400 倍［8］。褪黑激素由肠嗜铬细胞(enterochromaffin cell，EC)合成［9］，通过激活特定的膜受体(melatonin receptor，MR)发挥它的一些生理效应。MT 可分为MT1、MT2 和MT3 亚型。MT 具有高亲脂性，因此可能会扩散到更深的层次，通过黏膜和黏膜下层，最终作用于黏膜肌层或肌间神经丛。许多文献［10］报道了MT 对胃肠道收缩和松弛作用，但对胃肠道的作用部位及机制尚不清楚。

MT 最大可能通过激活胃肠平滑肌细胞膜上的MR 改变胃肠道蠕动，并有强有力的证据表明结合位点MT2 受体。体内动物研究表明，MT 对肠道兴奋性和抑制效果取决于MT 的剂量。小剂量的MT 加速大鼠肠道传输，而高剂量则有抑制肠道传输作用。这些影响被luzindole 阻断，提示肠道MR 的参与［11］。结合本研究中IBS-C 组MR 表达高于正常对照组，而正常对照组高于IBS-D 组，推测IBS-C 组高剂量MT 抑制肠道传输，导致便秘，IBS-D 组小剂量MT 加速肠道传输导致腹泻。

在电生理学实验中已经证明，MT 抑制平滑肌结电位的氮成分，这可能是由MT 在肠溶性突触直接抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的活性的结果。其他研究表明，MT 可能阻碍N 型通道或通过与Ca2+激活的K+通道相互作用来调节胃肠功能［12］。

MT 的其他作用靶点可能是5-HT 受体。一项研究表明，高剂量的MT 在胃肠道中与缩胆囊素-2 和5-HT 受体上的迷走神经传入纤维相互作用，从而诱导经迷走神经抑制反射［13］。有报道［14］证明MT 通过拮抗5-HT 受体产生松弛作用。MT 能抑制5-HT 转运体的活性，控制5-HT 在肠上皮细胞的再摄取，并通过作用于黏膜层的MT3 受体抑制NK2 受体触发的结肠黏膜5-HT 释放［15］。这些作用可能会同时影响肠道的分泌。结合本研究IBS-C 患者MR 高表达，推测MT 拮抗5-HT 作用，导致便秘症状，相反，IBS-D 患者MR 低表达，MT 拮抗5-HT 作用弱，导致腹泻症状。

MT 参与肠道离子转运的调控。外源性MT 可减轻小鼠结肠炎腹泻，但所涉及的机制尚未完全阐明［16］。在结肠，MT 被认为调节氯的分泌［17］。MT 可以影响COX-2 和iNOS 的表达和调节小鼠远端结肠由前列腺素E 诱导产生的分泌。其中部分分泌的影响似乎局限于结肠上皮细胞涉及cAMP 途径，而另一些涉及到肠神经系统［18］。根据这些研究，提示MT 是下消化道离子运输的生理调节剂。结合本研究推测IBSC 患者MT 高表达，可能MT 对肠道离子调控，减少肠道分泌导致便秘。

本研究提示IBS 症状与结肠黏膜MR 表达相关。多项临床研究提示MT 可改善IBS 症状［19-20］。有文献［21］表明，MT 的镇痛效果不是通过MR 介导，而是通过脊椎上通路连接到中央阿片系统中。因此，MT 对IBS 的作用既有对胃肠道组织各种直接影响，又有中枢神经系统参与。

综上所述，IBS 发病机制复杂，越来越多的研究表明MT 作为一种神经内分泌激素在IBS 发病机制中起重要作用，也提示MT 是一种治疗IBS 有前景的药物。

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