血府逐瘀汤中桔梗牛膝对血瘀大鼠芍药苷药代动力学的影响

黄 巍，熊 伟，唐 灿，毛旭华，由凤鸣

引经理论始于金元时期， 在总结归经理论的基础上提出，称引经药能够引导诸药直达病所[1-2]。 血府逐瘀汤方出自王清任的《医林改错》，方中具有“引药上行”的桔梗和“引血下行”的牛膝两味引经药。 方中赤芍的主要有效成分芍药苷具有抑制血小板聚集、扩张血管等药理作用[3-4]，与血府逐瘀汤方活血化瘀的功效方向一致。 本研究就血府逐瘀汤中引经药的有无是否会影响方中有效成分芍药苷的药代动力学特性展开。 由于处于生理与病理状态下大鼠体内芍药苷的药动学特性可能不同，故本研究采用血瘀模型大鼠分别灌胃同剂量（以芍药苷计）的血府逐瘀汤全方（简称全方）、血府逐瘀汤缺桔梗方（简称单缺桔梗方）、血府逐瘀汤缺牛膝方（简称单缺牛膝方）、血府逐瘀汤缺桔梗牛膝方（简称缺桔梗和牛膝方）药液，研究桔梗、牛膝的配伍对芍药苷药代动力学的影响，初步探讨桔梗、牛膝的“引经作用”。

1 材料与方法

1.1 仪器 SPD-10Avp 型紫外-可见光检测器（日本岛津）；LC-10ATvp 型高效液相色谱仪（日本岛津）；FA1004 型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)。

1.2 药品和试剂 中药饮片均购自四川本草堂药业，经成都中医药大学张廷模教授鉴定合格。 芍药苷对照品 （成都普菲德生物技术有限公司， 批号：121207，HPLC 含量≥98%）；核黄素对照品(成都植标化纯生物技术有限公司， 批号：130114，HPLC 含量＞98%)；葡聚糖T500（北京雅安达生物技术有限公司，批号：F0115）；甲醇、乙腈为色谱纯。

1.3 实验动物 SD 大鼠24 只， 雌雄各半， 体重180～220 g，购自四川省中医药科学院，动物合格证号：SCXK(川)2013-19。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流动相为乙腈- 水（16:84），流速1.0 ml/min，检测波长230 nm，核黄素为内标物，进样量20 μl。

1.4.2 药液制备 按全方、单缺桔梗方、单缺牛膝方、缺桔梗和牛膝方的处方剂量，分别称取45 倍处方量药材，加水10 倍量，浸泡30 min，煎煮3 次，30 min/次，合并过滤煎液，滤液转移至旋转蒸发器浓缩8 h，真空干燥箱干燥[5-6]，分别得全方、单缺桔梗方、 单缺牛膝方、 缺桔梗和牛膝方提取物粉末426、1054、948、650 g， 粉末 中 芍 药 苷 含 量 分 别 为2290.35、2620.40、3365.82、3119.59 μg/g。 称取提取物粉末各4.0 g，依次加入4.0、4.6、5.9、5.4 ml 水，搅拌使完全溶解，即得不同组方药液。

1.4.3 溶液配制 芍药苷工作液： 精密称取芍药苷对照品6.63 mg 于干燥棕色50 ml 容量瓶中，甲醇溶解定容， 摇匀即为对照品储备溶液， 浓度为130.0 μg/ml。 取对照品储备溶液适量， 用水稀释成浓度为1.0 μg/ml，即得芍药苷工作液。

内标工作液： 精密称取核黄素对照品4.80 mg于干燥棕色50 ml 容量瓶中，70%甲醇溶解定容，摇匀即为内标储备溶液，浓度为94.1 μg/ml。 取内标储备溶液适量，用水稀释60 倍即得内标工作液，浓度为1.57 μg/ml。

5%葡聚糖T500 溶液： 精密称取葡聚糖T500 0.2 g 加入0.9%氯化钠注射液4.0 ml，水浴加热并搅拌，使其完全溶解，溶液呈无色透明，0 ℃冷藏备用。

1.4.4 动物分组、造模与给药 24 只大鼠禁食12 h，自由饮水。采用5%葡聚糖T500 溶液，按2 ml/kg尾静脉推注[7]，建立血瘀模型。 30 min 后，将模型大鼠随机分为全方组、单缺桔梗方组、单缺牛膝方组、缺桔梗和牛膝方组，每组6 只，雌雄各半。按5 ml/kg体重，相应灌胃全方、单缺桔梗方、单缺牛膝方、缺桔梗和牛膝方药液，以芍药苷计灌胃剂量为11.452 mg/kg。

1.4.5 检测 分别于灌胃后10 min、15 min、30 min、45 min、1.5 h、2.5 h、4 h，自大鼠眼眶静脉丛取血，静置10～20 min，5000 r/min 离心10 min，取血清100 μl，加入乙腈250 μl、 内标工作液20 μl，2000 r/min 旋涡沉淀蛋白，5000 r/min 离心10 min， 转移上清液，40 ℃水浴通氮吹干，100 μl 水复溶，20 μl 进样，高效液相色谱仪检测芍药苷的含量[8]。

1.5 统计学方法 运用SPSS13.0 软件分析，实验数据以±s 表示，药动学参数AUC(0-t)、Cmax取自然对数后进行单因素方差分析，Ka、Ke、Tmax、t1/2进行非参t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠灌胃后，按“1.4.5 检测”项下检测，记录色谱图， 芍药苷与内标物的峰面积比值代入标准曲线方程，计算出血清中芍药苷浓度(图1)。药时曲线数据经DAS2.0 软件拟合药代动力学参数(表1)。基于缺桔梗和牛膝方， 芍药苷药动学参数直接比较后结果为：单缺牛膝方能增大芍药苷Ke，减小AUC(0-t)、Ka、Cmax、Tmax、t1/2；单缺桔梗方能增大芍药苷AUC(0-t)、Tmax、t1/2，减小Ka、Ke、Cmax；全方能增大Ke、Cmax，减小AUC(0-t)、Ka、Tmax、t1/2。

3 讨论

引经药桔梗被称为能“载药上行”，引经药牛膝被称为能“引血下行”。 桔梗、牛膝作为引经药使用，能否影响芍药苷的药代动力学特性？ 两味引经药的作用一升一降，配伍使用后“引经作用”减弱或加强？基于缺桔梗和牛膝方，药动学参数直接比较发现：单缺牛膝方和单缺桔梗方对芍药苷的Ke、AUC(0-t)、Tmax、t1/2的影响趋势相反， 对参数Ka、Cmax的影响趋势同为减小；桔梗、牛膝配伍使用(全方)对参数Ka、Cmax的影响趋势变为增大，对参数AUC(0-t)、Tmax、t1/2的影响趋势同单缺牛膝方。 然而，药动学参数统计比较发现：参数AUC(0-t)、Ka、Cmax组间差异无统计学意义；全方组Ke 明显大于单缺桔梗方组、 缺桔梗和牛膝方组(P ＜0.05)；全方组t1/2明显小于单缺桔梗方组、缺桔梗和牛膝方组(P ＜0.05)；单缺桔梗方组Tmax明显大于全方组、单缺牛膝方组(P ＜0.05)。 因此，本实验结果说明：桔梗、牛膝作为引经药的使用，确能影响芍药苷部分药代动力学参数；桔梗、牛膝配伍明显影响芍药苷的Ke，使“引经作用”加强。

图1 血瘀大鼠灌胃不同组方药液后药时曲线(n=6)

有学者认为，应立足于中药在体内发挥作用的各关键环节，展开“引经作用”的探讨[9]。 根据本实验结果，拟从芍药苷在体内“吸收- 分布- 消除”过程，对桔梗、牛膝引经作用机理进行假设：桔梗和牛膝中某些成分与芍药苷在体内存在既竞争又促进的关系。 吸收过程(Ka、Cmax、Tmax)：单缺牛膝方和单缺桔梗方主要表现为竞争吸收； 桔梗牛膝配伍使用(全方)，主要表现为促进吸收。所以，血瘀大鼠灌胃全方后，Ka、Cmax都高于任何一个缺引经药方， 而Tmax都不高于任何一个缺引经药方。 血瘀大鼠灌胃单缺桔梗方或单缺牛膝方，Ka、Cmax都低于缺桔梗和牛膝方。 分布过程(V)：给药途径为灌胃，F 未知，表观分布容积(V)和清除率(CL)都未知，但V/F 灌胃全方后最小，表明引经药能影响芍药苷的体内分布。 消除过程(Ke)：桔梗和牛膝中的某些成分和芍药苷可能表现为竞争关系， 如这些成分更易与血中蛋白结合，使血中游离芍药苷增多，芍药苷就更易被消除，故血瘀大鼠灌胃全方、 单缺牛膝方后，Ke 高于缺桔梗和牛膝方；这些成分与芍药苷也可能表现为促进关系，如促进游离芍药苷向组织脏器转移，使芍药苷消除变慢， 故血瘀大鼠灌胃单缺桔梗方后，Ke 低于缺桔梗和牛膝方。

本研究证实了桔梗、牛膝的引经作用，并从“吸收-分布-消除” 过程展开了引经作用机理的设想。虽不能揭示具体的引经作用机理，但表明需从吸收部位、血中蛋白结合、组织分布、代谢部位、排泄途径等角度来进一步研究引经作用机理。

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[9] 林彦君，章津铭. 新议桔梗“引经报使”理论研究思路与方法[J]. 中药与临床，2011，2(2)：50-52.