半夏泻心汤全方及其不同组分对幽门螺杆菌感染小鼠的作用及机制分析

吴新辉，周烨鑫，成克用，吴润秋

(长沙医学院，湖南 长沙 410219)

幽门螺旋杆菌(Hp)是定植于胃肠道黏膜的螺旋状、微需氧革兰氏阴性杆菌，Hp感染是造成慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等上消化道疾病的重要病因[1-2]。消化道黏膜局部的Hp能够通过模式识别受体TLR2、TLR4来激活炎症反应，进而造成消化道黏膜损伤。此外，长期Hp感染还会造成原癌基因激活、增加胃癌的发生风险[3]。因此，根除Hp是预防和治疗多种上消化道疾病的关键。半夏泻心汤出自张仲景的《伤寒论》，是治疗“心下痞”的代表性中药方剂，被证实能够在消化性溃疡的治疗中取得积极治疗效果[4]。该方剂包含具有清热解毒作用的组分和具有扶正补益作用的组分，关于不同组分对幽门螺杆菌的根除作用尚未明确,因此在下列研究中，我们具体分析了半夏泻心汤全方及不同组分治疗幽门螺杆菌感染小鼠的疗效及分子机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

选择C57小鼠作为实验动物，均为雄性，6～8周龄,体质量18～22 g，购于湖南动物实验中心，动物许可证号SCXK 20120005。

半夏泻心汤全方由生半夏、黄芩、黄莲、干姜、人参、大枣、甘草组成，清热解毒组分由黄芩、黄连组成，扶正补益组分由人参、大枣组成，药剂科按常规煎煮,浓缩为1 g/ml的溶液。

幽门螺旋杆菌SS1(ATCC公司)；RIPA蛋白裂解液和BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；酶联免疫吸附试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 Hp培养及菌液制备方法

将SS1幽门螺旋杆菌在含有8%脱纤维羊血清的哥伦比亚血琼脂培养基中复苏，在15% CO2、5%O2、80%NO2的微需氧环境下培养48～72 h，阳性菌落扩增培养，经快速尿素酶鉴定后用布氏肉汤收集SS1幽门螺旋杆菌并调节密度至109CFU/ml，备用。

1.2.2 动物分组及造模方法

实验动物随机分为对照组、模型组、干预A组、干预B组、干预C组。模型组及3组干预组均按下列方法建立幽门螺旋杆菌感染的动物模型：禁食24 h后给予5%碳酸氢钠溶液灌胃，30 min后给予含有109CFU/ml SS1幽门螺旋杆菌的菌液0.2 ml灌胃，连续灌胃4次、每次间隔48 h。对照组每次给予等剂量生理盐水灌胃。

1.2.3 药物干预方法

干预A组给予半夏泻心汤全方进行干预，用全方原药材浓度为1 g/mL的药液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,连续8天。干预B组给予半夏泻心汤清热解毒组分(黄芩、黄连)进行干预，用黄芩、黄连原药材浓度为1 g/mL的药液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,连续8天。干预C组给予半夏泻心汤扶正补益组分(人参、大枣)进行干预，用人参、大枣原药材浓度为1 g/mL的药液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,连续8天。模型组用0.2 ml的生理盐水灌胃。

1.2.4 幽门螺旋杆菌根除评估方法

干预8天后，处死5组小鼠，取胃组织并沿胃大弯剪开，DEPC水冲洗胃内容物后取一半胃黏膜组织，分别进行快速尿素酶(RUT)试验和W-S染色，RUT试验和W-S染色均为阴性的样本为幽门螺旋杆菌阴性,判定幽门螺旋杆菌根除。

1.2.5 胃黏膜内炎症反应程度评估方法

取DEPC水冲洗后的另一半胃黏膜组织，加入RIPA裂解液后充分匀浆，提取组织中的蛋白质，采用BCA试剂盒测定总蛋白含量，酶联免疫吸附试剂盒测定TLR2、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的含量，计算每毫克总蛋白中TLR2、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的表达量。

1.2.6 统计学方法

采用SPSS20.0软件录入数据并进行统计分析，多组间计量资料的比较采用方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 幽门螺旋杆菌根除情况

模型组幽门螺旋杆菌的感染率为100%、根除率0%；干预A组幽门螺旋杆菌治疗后的感染率为25.0%(2/8)、根除率75.0%；干预B组幽门螺旋杆菌治疗后的感染率为62.5%(5/8)、根除率37.5%；干预C组幽门螺旋杆菌治疗后的感染率为75.0%(6/8)、根除率25.0%。经卡方检验，干预A组、干预B组、干预C组的幽门螺旋杆菌根除率均高于模型组(P<0.05)，干预A组的幽门螺旋杆菌根除率高于干预B组和干预C组(P<0.05)，干预B组与干预C组间幽门螺旋杆菌的根除率比较无显著性差异(P>0.05)。

2.2 胃黏膜中TLRs/NF-κB通路表达量的比较

模型组小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表达量显著高于对照组(P<0.05)，干预B组和C组、干预B组、干预C组小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表达量显著低于模型组(P<0.05)，干预A组小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表达量显著高于干预A组(P<0.05)，干预B组与干预C组间胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表达量比较无显著性差异(P>0.05)。具体情况见表1。

表1 各组小鼠胃黏膜中TLRs/NF-κB通路表达量的比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，&P<0.05；与干预A组比较，aP<0.05

2.3 炎症介质表达量的比较

模型组小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表达量显著高于对照组(P<0.05)，干预A组、干预B组、干预C组小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表达量显著低于模型组(P<0.05)，干预B组和C组小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表达量显著高于干预A组(P<0.05)，干预B组与干预C组间胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表达量比较无显著性差异(P>0.05)。具体情况见表2。

表2 各组小鼠胃黏膜中炎症介质表达量的比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，&P<0.05；与干预A组比较，aP<0.05

3 讨论

幽门螺旋杆菌(Hp)感染是引起慢性胃炎、消化性溃疡等慢性上消化道疾病的主要致病因素，Hp长期未能根除会诱导胃黏膜萎缩以及肠上皮化生，进而增加胃癌、胃相关恶性淋巴瘤等恶性肿瘤的发生风险[5-6]。因此，根除Hp是治疗和预防多种上消化道疾病的有效手段。中医学认为，Hp感染能够引起寒热错杂、胃热脾寒，清热解毒、扶正补益是中医根除Hp感染的常规思路。已有临床研究表明，半夏泻心汤治疗Hp阳性的消化性溃疡能够取得确切疗效[7]；相关基础研究证实，半夏泻心汤的含药血清能够有效抑制Hp的体外繁殖[8]。在本研究中，为了明确半夏泻心汤对Hp在体繁殖的影响，我们对半夏泻心汤全方及各组分干预后的Hp清除率进行了分析，半夏泻心汤全方干预后的Hp清除率达到75.0%，而热解毒组分及扶正补益组分干预后的Hp清除率达到37.5%和25.0%。这就说明半夏泻心汤全方及各组分均具有一定的Hp清除作用，半夏泻心汤全方对Hp的清除价值优于清热解毒组分及扶正补益组分干预。由此也提示，半夏泻心汤对Hp的清除作用依赖于各种药物成分的配伍，单独使用各组分无法达到半夏泻心汤全方的药理价值。

Toll样受体(TLRs)是体内重要的模式识别受体，能够识别多种病原模式分子并调节炎症反应[9-10]。在Hp的感染过程中，TLRs中的TLR2和TLR4能够识别局部胃黏膜中的Hp，进而通过下游MyD88、IRAK、TRAF6等接头分子来激活NF-κB，激活后的NF-κB转位进入细胞核并启动多种炎症介质的表达、激活胃黏膜内的炎症反应[11-12]。本研究证实，模型组小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表达量显著高于对照组,说明幽门螺旋杆菌作为一种病原模式分子，能够显著激活TLR2、TLR4，进而增加核转录因子NF-κB的表达。进一步分析半夏泻心汤对幽门螺旋杆菌感染过程中TLRs/NF-κB通路的影响,可知经过半夏泻心汤全方及各组分干预后，小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表达量显著低于模型组，且半夏泻心汤全方干预后，小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表达量显著低于各组分的干预。由此说明半夏泻心汤全方及清热解毒组分、扶正补益组分均能显著抑制幽门螺旋杆菌感染过程中TLRs/NF-κB通路的激活，且半夏泻心汤全方干预对TLRs/NF-κB通路的抑制效应优于单独使用清热解毒组分及扶正补益组分进行干预。

TLR2和TLR4激活所介导的NF-κB转位入核能够启动TNF-α、IL-6、IL-8等多种炎性因子的表达[13]。TNF-α是在炎症反应启动过程中最先发生改变的细胞因子，不仅能够直接造成局部组织发生炎症反应、介导炎症性损伤，还能促进多种炎症细胞在病灶内浸润、放大炎症反应[14]。IL-6是具有多种生物学效应的细胞因子，能够调节炎症反应和免疫应答，在炎症反应的级联放大过程中发挥关键作用[15]。IL-8是重要的内源性趋化因子，能够促进单核巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞在病灶内的迁移和浸润，进而激活炎症反应[16]。本研究对胃黏膜中上述炎症介质表达量的分析证实,模型组小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表达量显著高于对照组。这就说明幽门螺旋杆菌感染过程中，TLRs/NF-κB通路的激活能够显著增加炎症介质TNF-α、IL-6、IL-8的表达。进一步分析半夏泻心汤对幽门螺旋杆菌感染过程中TLRs/NF-κB通路下游炎症介质表达的影响可知,半夏泻心汤全方及各组分干预后，小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表达量显著低于模型组,且半夏泻心汤全方干预后，小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表达量显著低于各组分的干预。由此说明半夏泻心汤全方及清热解毒组分、扶正补益组分均能显著抑制幽门螺旋杆菌感染过程中TNF-α、IL-6、IL-8的分泌，且半夏泻心汤全方干预对TNF-α、IL-6、IL-8分泌和表达的抑制效应优于单独使用清热解毒组分及扶正补益组分进行干预。

综上所述，半夏泻心汤全方及各组分均能根除Hp并抑制TLRs/NF-κB信号通路，且全方的疗效优于各组分；在临床实践中应用半夏泻心汤全方治疗Hp感染能够取得积极临床疗效。

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