副猪嗜血杆菌对豚鼠和小鼠的致病力研究

王占伟，刘茂军，王 丽，邵国青

（江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京210014）

WANG Zhan-wei，LIU Mao-jun，WANG Li，SHAO Guo-qing

（Institute of Veterinary Medicine，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology，Ministry of Agriculture/National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products，Nanjing 210014，China）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是猪上呼吸道的一种常在菌，也被认为是一种条件性致病菌，即在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病，称为格拉泽氏病（Glasser′s disease），该病呈世界性分布，给养猪业造成了严重的损失，尤其是在近10 多年的时间里。基于Kieletein-Rapp-Gabriedson（KRG）琼脂扩散血清分型方法[1]，将Hps分为15 个血清型，另有20%～40%分离株的血清型不可定。以血清流行病学调查为主的结果显示，国外主要流行血清4、5 型和13 型Hps[2-3]，国内Hps 的流行情况与其型相似，以血清5 型和4 型为主，其次为血清12 型和13 型[4-5]。研究表明，毒力与血清型有一定关系，即血清1、5、10、12、13 型和14 型Hps的毒力最强，血清2、4 型和15 型Hps 的毒力次之，而血清3、6、7、8、9 型和11 型无毒力[6-7]。对于血清型较多的Hps，选择一种合适的实验动物作为攻毒模型，是进行防治研究的关键之一，目前，国内外使用的实验动物有SPF猪[8]、剖腹产未吃初乳（CDCD）猪[9]、自然分娩未吃初乳（NFCD）猪[10]、人工助产未吃初乳（SFCD）猪[11]，但由于其对于试验条件的要求和成本均较高，使得其应用于实际研究有局限性。因此，很多学者已探索用豚鼠和Balb/c 小鼠作为替代动物模型[12-14]。本文将以豚鼠和Balb/c 小鼠为攻毒模型，评价Hps 分离株FS0307 株、XX0306 株和标准株HS1079 株的致病力。

1 材料与方法

1.1 菌株 Hps 血清4 型分离株FS0307 株、血清5 型分离株XX0306 株，由本所分离保存；血清13型标准株HS1079 株，由北京市农林科学院惠赠。

1.2 动物 4 周龄的豚鼠、6 周龄Balb /c 小鼠，购自扬州大学实验动物中心；自由采食和饮水。

1.3 材料 胰酶大豆琼脂（TSA）和胰酶大豆肉汤（TSB）培养基（英国Oxioid 公司）；新生牛血清（兰州民海）；NAD（国药）；TSA、TSB 配制后添加10%新生牛血清和0.01% NAD。Hps 间接血凝（IHA）检测试剂，本所制备。

1.4 菌株培养 TSA 平板复苏培养Hps 血清4 型分离株FS0307株、血清5型分离株XX0306株和血清13型标准株HS1079 株，挑取单菌落用TSB 液体培养基培养12 h 做为种子液，将种子液按培养基总体积的5%接种于TSB 液体培养基，37 ℃振荡培养18 h，平板计数细菌；按所需浓度进行浓缩或稀释。

1.5 Hps 对豚鼠的毒力 20 只豚鼠随机分成4 组，其中，3 组攻毒组，每组5 只；1 组对照组，5 只。3 组攻毒组分别用Hps FS0307 株、XX0306 株和HS1079株通过腹腔接种，每只1 mL（5×109CFU）。对照组腹腔注射生理盐水，每只1 mL。攻毒后每天观察并记录豚鼠的临床表现和死亡情况，直到第10 天。对所有死亡和10 d 后未死亡豚鼠进行剖检，观察并记录各组织器官的病变，同时无菌取腹腔液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行细菌的分离，以确认Hps 的感染，并用Hps IHA 试剂检测血清抗体。

1.6 Hps 对小鼠的毒力 取20 只Balb/c 小鼠，随机分为4 组，3 组攻毒组和1 组对照组，每组5只。3 组攻毒组分别用Hps FS0307 株、XX0306 株和HS1079 株通过腹腔接种，每只0.5 mL（1×109CFU）。对照组腹腔注射生理盐水，每只0.5 mL。感染后临床观察10 d，记录小鼠的临床表现和死亡情况，对死亡小鼠和10 d 后耐过的小鼠进行剖检，观察并记录各组织器官的病变，无菌取腹腔液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏接种TSA 平板进行Hps 再分离，并用Hps IHA 试剂检测血清抗体。

2 结果

2.1 感染结果 Hps 感染豚鼠10 h 内，开始出现呼吸加快、精神沉郁、被毛粗乱等症状，且10 h 后开始死亡，若3 d 内未死亡的豚鼠，则耐过存活。连续观察10 d 后的结果见表1。剖检发现，死亡豚鼠均发现多脏器有出血。

表1 豚鼠感染结果

Hps 感染小鼠3 h 后，开始出现精神沉郁、厌食、震颤、背毛竖立、扎堆、不运动等临床表现，且24 h 后开始死亡，若3 d 内未死亡的小鼠，则耐过存活。连续观察10 d 后的结果见表2。剖检发现，FS0307 株攻毒组和XX0306 株攻毒组死亡的1只小鼠的腹腔有轻微粘连。

表2 小鼠感染结果

2.2 Hps 再分离结果 无菌取所有死亡、存活豚鼠的腹腔液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行分离Hps。结果显示，FS0307 株攻毒组、XX0306 株攻毒组、HS1079 株攻毒组和对照组的实验豚鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官均未分离出Hps；而除了对照组和HS1079 株攻毒组存活的1 只豚鼠外，3组攻毒组豚鼠的腹腔液均分离到Hps。

无菌取各组死亡和存活小鼠的腹腔液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行分离Hps。结果显示，FS0307 株攻毒组、XX0306 株攻毒组、HS1079株攻毒组和对照组的实验小鼠的腹腔液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官均未分离出Hps。

2.3 血清抗体的IHA 检测结果 取各组死亡和未死亡的豚鼠、小鼠的血液，IHA 检测血清抗体。结果显示，Hps 感染的各组小鼠、豚鼠的血清抗体均为阴性。

3 分析与讨论

Hps 一般出现在混合感染的病例中，因此学者们通常认为Hps 是某些疫病（如PCV2 感染、Mhp 感染或PRRSV 感染）的继发病原，其原因是PCV2 或PRRSV 能诱导感染动物免疫抑制，为细菌的继发创造条件[15-16]，因此单独感染或者用普通猪来作实验动物感染，成功的几率很低。本文以豚鼠和Balb/c小鼠作为替代攻毒模型动物进行试验，从临床症状结果可知，Hps 血清4 型分离株FS0307 株、血清5 型分离株XX0306 株和血清13 型标准株HS1079 株均能引起小鼠和豚鼠100%发病，说明3 个血清型的菌株的毒力均较强，与Kielstein 等[1]和Oliveira 等[10]报道的基本一致；而且2 株分离菌株对豚鼠的致死率达到100%，对小鼠的致死率为20%；而标准株对豚鼠的致死率也达到80%，不致死小鼠，说明分离株的致病力强于标准株，且豚鼠对Hps 的敏感性强于小鼠。在选用何种动物作为攻毒模型动物时，动物的敏感程度是首先要考虑的，再结合实验的稳定性及其他因素综合评价，从而确定模型动物。根据已有报道[13]，以及本试验的结果，相比较而言，豚鼠更适合作为Hps 的攻毒模型动物。

在Hps 攻毒后进行再分离过程，由于死亡或者健活的小鼠和豚鼠均无腹腔液，故采用无菌生理盐水冲洗腹腔的方法制备腹腔冲洗液，再用其进行分离和鉴定。分离结果说明，从小鼠和豚鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和存活动物的腹腔冲洗液不容易再次分离到Hps，这与贺云霞等[14]的结论基本一致，而与李雪松等[17]在小鼠肺脏、脾、心血中分离到Hps 的结果不一致。但在接种Hps 后很快死亡的豚鼠腹腔冲洗液中可分离到Hps，有可能是有部分活菌还存留在腹腔中。从Hps 感染各组小鼠、豚鼠的血清抗体均为阴性的结果，猜测有两个因素：一是IHA 的敏感性较低；二是感染动物本身还未产生抗体或者产生的抗体效价还很低。

本研究以经典的实验动物-豚鼠和Balb/c 小鼠为模型，评价了Hps 血清4 型分离株FS0307 株、血清5 型分离株XX0306 株和血清13 型标准株HS1079 株的毒力，这不仅为Hps 的攻毒模型提供了依据，也为副猪嗜血杆菌病疫苗的研究奠定了基础。

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