硫酸软骨素对LLO诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO、ET-1的影响

陈希，穆祥，许剑琴

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.北京农学院动物科学技术学院，北京102206；3.中国农业大学动物医学院，北京 100094)



硫酸软骨素对LLO诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO、ET-1的影响

陈希1，穆祥2*，许剑琴3*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.北京农学院动物科学技术学院，北京102206；3.中国农业大学动物医学院，北京 100094)

为研究李斯特菌溶血素(LLO)对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMVECs)分泌NO、内皮素(ET-1)的影响，以及硫酸软骨素(CS)通过调节细胞微环境保护RIMVECs的作用，将体外培养的RIMVECs分为LLO+CS组、LLO组、CS组、空白组，经过MTT比色法测定细胞生长情况，硝酸还原酶法测定细胞上清液细胞因子NO含量以及酶联免疫法检测ET-1含量，并用原位杂交方法对结果进行验证。结果表明：LLO可抑制RIMVECs增殖活性，提高NO、ET-1分泌量且高于正常水平，并导致NO/ET-1比值失衡(下降)；而CS可提高RIMVECs细胞的增殖活性，并显著上调NO/ET-1比值。由此可知，CS可通过改善LLO引起细胞因子NO和ET-1失衡而起到保护微血管内皮细胞的作用。

硫酸软骨素；肠黏膜微血管内皮细胞；NO；ET-1；LLO

产单核细胞李斯特菌(L.monocytogenes，LM)的致病机理是通过分泌致病因子溶血素(Listeriolysin O，LLO)作用于内皮细胞，导致细胞因子分泌紊乱，从而诱发机体产生病理症状[1]。硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是由动物软骨分离得到的一种硫酸多糖，是细胞外基质的主要成分，也是动物类中药(骨类、角类)的重要成分之一，具有降血脂、抗凝、抗血栓形成，并有保护血管内皮免受多种化学物质损伤的作用[2]。近年来，CS作为硫酸多糖之一，具有抗凝血、调节细胞黏附、调节炎症、调节免疫、阻碍血管生成、抗氧化等多种药理活性[3-5]。其对体外人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用亦有报道[6]。针对文献所报道的CS具有保护内皮细胞、调节细胞因子的作用，本研究首次以大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(Rat Intestinal Mucosal Microvascular Endothelial Cells, RIMVECs)为试验对象，研究CS调节LLO导致的细胞微环境紊乱，以及对LLO致RIMVECs损伤的作用效果。

1 材料和方法

1.1 试剂及药品材料 硫酸软骨素标准品,HPLC≥98%, 批号A0318，成都曼思特生物科技有限公司；LLO,ProSpec-TanyTechnoGene公司；DMEM 培养基、优级胎牛血清,Gibco公司；NO测试试剂盒,晶美生物工程有限公司；内皮素(ET-1)酶联免疫检测试剂盒,RB，北京尚柏生物公司；原位杂交检测试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司，产品编号分别为MK1059、MK1190。

1.2 仪器与设备 CO2恒温培养箱(MCO-17AC型，日本三洋公司)；倒置数码荧光显微镜(DMB5型，厦门麦克奥迪公司)；细胞培养板(6、12、48孔，costar公司)；细胞计数板(浙江玉环求精医用仪器厂)。

1.3 试验方法

1.3.1 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分离培养 选择出生24 h之内SD大鼠，用无菌方法取出空肠，Hank’s液冲洗，纵向切开。冲洗后将组织剪成小段，吹打数次，经胰酶消化暴露出微血管网，接种于24孔细胞培养板中。加入DMEM完全培养基(含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、10 μg/mL链霉素)，于37 ℃、5%CO2培养箱培养，3 d换液1次，细胞达到80%融合生长时即行传代。倒置显微镜下，细胞呈典型的铺路石状相嵌排列，无重叠生长现象；免疫荧光法检测内皮细胞vWF因子相关抗原阳性。

1.3.2 细胞准备及处理 用0.25%胰蛋白酶消化已经融合生长的第2代RIMVECs，细胞悬液接种于96孔细胞培养板，细胞密度5×108/L。每孔加150 μL DMEM完全培养基，置37 ℃、5% CO2培养箱培养，待融合成单层细胞后，将RIMVECs分为LLO+CS组(培养基中LLO浓度为50 ng/mL+CS浓度为10 μg/mL)、LLO组(LLO浓度为50 ng/mL)、CS组(CS浓度为10 μg/mL)、空白组(LLO浓度为0 ng/mL)，每组设重复孔5孔，空白对照组加维持培养液，分别于培养3、6、9、12 h后收集细胞培养液，3000 r/min离心5 min后，取上清液于-20 ℃条件待测。

1.3.3 细胞增殖活性的测定(MTT法) 根据文献方法[7]，将96孔细胞培养板置入CO2培养箱中，37 ℃静置培养24 h。吸净细胞上清液后，在各孔细胞中加入5 mg/mL的MTT 30 mL及150 mL的DMEM维持培养基，继续培养4 h后，轻轻吸弃孔内液体，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃孵育30 min 以上，使细胞内结晶充分溶解，于酶标仪570 nm波长处测定各组OD值。

1.3.4 细胞上清液中NO、ET-1浓度的测定 根据文献方法[8]，NO浓度的测定采用硝酸还原酶法。参照试剂盒说明，以总硝酸盐(NOx)含量表示NO 浓度。ET-1浓度的测定按照ELISA试剂盒的操作步骤进行。

1.3.5 原位杂交 根据文献方法[8]，针对大鼠诱生型一氧化氮合酶(iNOS)靶基因的mRNA 序列为：5’-GGAAAAGGACATTAACAACAACGTGGAGAA-3’；5’-GACCAGAGGACCCAGAGACAAGCCCACCCC-3’；5’-CTTCCAGCTCAAGAGCCAGAAACGTTATCA-3’。

针对大鼠ET-1 靶基因的mRNA 序列为：5’-GTGACTTTCCAAGGAGCTCCAGAAACAGCTGTCTT-3’；5’-AAGACAAGAAGTGCTGGAATTTCTGCCAAGCAGGA-3’

采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法。将处理后12 h各组细胞滴加含有1/1000 DEPC的4%多聚甲醛固定，3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化，加地高辛标记的寡核苷酸探针杂交，封闭，滴加兔抗地高辛，滴加生物素化羊抗兔IgG， 3,3-二氨基苯联胺(DAB) 显色，阳性结果呈棕黄色。

2 结果与分析

2.1 CS抗LLO对RIMVECs增殖的影响 由图1可知，LLO组与其他各组相比，细胞增殖(OD值)极显著下降(P<0.01)。试验结果表明，LLO对细胞起负增殖作用，即抑制细胞增殖或对细胞造成损伤，而CS有效缓解了细胞损伤。

2.2 CS对LLO诱导RIMVECs分泌NO、ET-1的影响 由表1可知，12 h内LLO组NO分泌量高于正常水平，而LLO+CS组NO分泌量高于LLO组，12 h内差异极显著(P<0.01)；与空白组对比，CS组RIMVECs的NO的分泌量于6-9 h有所上调，12 h时测得NO值和空白组无显著差异(P>0.05)，说明CS短期内具有上调RIMVECs分泌NO的作用。由表2可知，LLO组细胞ET-1分泌量高于空白组(P<0.01)；与LLO组相比，LLO+CS组分泌量于6h开始明显下降(P<0.05)，说明CS对LLO诱导RIMVECs分泌ET-1的升高有显著抑制作用。

*表示与空白组对照， **代表P<0.01，*代表P<0.05;# 表示与LLO组对照， ## 代表P<0.01图1 CS抗LLO对RIMVECs增值的影响(12 h)

表1 各时间段细胞上清NO浓度的测定结果 mol/L

*表示与空白组对照， ** 代表P<0.01，*代表P<0.05； # 表示与LLO组对照，## 代表P<0.01，# 代表P<0.05

表2 各时间段细胞上清ET-1浓度的测定结果 pg/mL

*表示与空白组对照， ** 代表P<0.01，*代表P<0.05； # 表示与LLO组对照，## 代表P<0.01，# 代表P<0.05

2.3 CS对LLO导致RIMVECs分泌NO、ET-1平衡紊乱的影响 生理状态下NO、ET-1是一对维持动态平衡的细胞因子,根据前面测定的各组细胞NO、ET-1分泌量，计算出NO/ET-1的比值，观察CS对维持细胞微环境稳定的影响。如图2所示，空白组比值维持在10左右，而CS有效缓解了LLO导致的NO/ET-1失衡。

图2 不同时间段测得各组细胞NO/ET-1的比值

2.4 阳性细胞胞浆平均光密度值 由表3和图3可知，处理后12 h，测定各组细胞平均光密度值与NO、ET-1 mRNA表达量测定值一致。

表3 NO、ET-1 mRNA表达阳性细胞胞浆平均光密度值(12 h)

A：空白组iNOS表达；B：LLO组iNOS表达；C：LLO+CS组iNOS表达；D：空白组ET-1 mRNA表达；E：LLO组ET-1 mRNA表达；F：LLO+CS组ET-1 mRNA表达图3 各组iNOS、ET-1 mRNA表达结果(12 h)

3 讨论与小结

血管内皮细胞受损是创伤、感染、休克、肿瘤、全身性炎症反应综合征以及多器官功能障碍发生、发展的病理学基础[9-11]。肠黏膜作为机体屏障部位，必然在肠道感染、细菌移位中起到关键作用。而肠黏膜上的微血管内皮细胞不仅是被动的靶细胞，更是一种效应细胞，可分泌NO对动、静脉和微血管均有扩张作用，能够抑制缺氧引起的血管收缩，并具有抗血栓形成的作用；而ET-1是目前已知的最强大的血管收缩剂，其作用正好同NO相颉颃，两者之间的动态平衡是调控血管壁紧张度，微血管内微血栓形成的重要因素。试验结果表明，CS可有效上调LLO诱导的NO分泌，同时下调RIMVECs分泌的ET-1，其实质是调节NO/ET-1的比值。药物通过调节一对互相颉颃的活性物质，使其从紊乱状态形成新的平衡，维持机体细胞微环境稳定，有效控制疾病的发生发展。

NO的合成需要一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的参与。NOS主要有诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和原生型一氧化氮合酶(cNOS)。本试验原位杂交中检测的iNOS在正常条件下不存在或少量表达，毒素或其他细胞因子刺激时诱导其基因表达，经数小时即可产生大量的NO。而cNOS在正常条件下即存在，是细胞结构的一部分，调控生理状态下NO的基础释放，其主要的生物效应为传递细胞间的信息。因此，原位杂交试验以iNOS作为检测标准。试验中测定各组细胞平均光密度值与NO、ET-1 mRNA表达量测定值一致，该比对结果证实了CS具有调控LLO诱导的RIMVECs分泌NO、ET-1的作用。

研究结果表明，RIMVECs是LLO作用的主要靶细胞，且CS可通过保护RIMVECs的增殖、调控LLO诱导的RIMVECs分泌NO、ET-1及mRNA表达。CS具有缓解LLO导致RIMVECs损伤的功效，将为后续的抗菌中药成分方剂研发提供一定理论依据。

[1] Kayal S, Lilienbaum A, Poyart C,etal.Listeriolysin O-dependent activation of endothelial cells during infection with Listeria monocytogenes: activation of NF-kB and upregulation of adhesion molecules and chemokines[J].Molecular Microbiology, 1999, 31(6): 1709-1722.

[2] 张爱娟, 周序斌, 张黎华,等.甘糖酯对实验性动脉内皮保护作用的研究[J].中国药理学通报, 1995,11: 323.

[3] 杨子默,胡华杰,占琦,等.硫酸软骨素蛋白多糖对神经系统损伤修复的影响[J].中国生化药物杂志,2015,3:189-191.

[4] 肖玉良,李平利,程艳娜,等.硫酸软骨素的药理作用及应用研究进展[J].中国药学杂志，2014，13：1093-1098

[5] 刘武.硫酸软骨素药理作用研究进展[J].中国药业,2008, 17(8): 64-44.

[6] 胡茂稳, 周序斌, 张黎华,等.硫酸多糖对体外人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用[J].药理学报, 1995, 30(9): 641-645.

[7] 关心，杨同华，张爱玲，等.附子中的新乌头碱对K562细胞增殖和凋亡的影响[J].北京中医药大学学报, 2015,7:37-42.

[8] Chen X, Xu J Q, Mu X,etal.Effects of rhynchophylline and isorhynchophylline on nitric oxide and endothelin-1 secretion from RIMECs induced by Listeriolysin Oinvitro[J].Veterinary Microbiology, 2010, 143: 262-269.

[9] Gonzalez A P,Sepulveda S, Massberg S,etal.Invivofluorescence microscopy for the assessment of microvascular reperfusion injury in small bowel transplants in rats[J].Transplantation, 1994, 58: 403-408.

[10]Kurose I, Granger D N.Evidence implicating xanthine oxidase and neutrophils in reperfusion-induced microvascular dysfunction[J].Ann N Y AcadSci,1994,723 :158-179.

[11]Suzuki M, Grisham M B, Granger D N.Leukocyte endothelial cell adhesive interactions :role of xanthine oxidase-derived oxidants[J].J Leukoc Biol, 1991,50 : 488-494.

(编辑：李文平)

Effects of Chondroitin Sulfate on the Secretion of NO and ET-1 in Rat Intestinal Mucosa Microvascular Endothelial Cells Induced by LLO

CHEN Xi1，MU Xiang2*, XU Jian-qin3*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;3.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)

The purpose of this study was to investigate the treatment mechanism of the chondroitin sulfate (CS) on the listeriosis and the secretion of NO and ET-1 in rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells (RIMVECs) induced by listeriolysin O (LLO).RIMVECs in culture were divided into LLO+CS, LLO, CS and blank control groups.Cells were assessed proliferation by MTT assay.The Changes of NO and ET-1 level were measured by the method of nitratase, ELISA and hybridizationinsitu.Compared with other groups, proliferation of LLO group was very significantly decreased.The production of NO and ET-1 were enhanced for 12 h, and NO/ET-1 ratio was lower.CS could regulate imbalance of NO/ET-1 induced by LLO and improve the local microcirculation of intestine.

chondroitin sulfate；intestinal mucosa microvascular endothelial cells；NO；ET-1；LLO

北京市自然科学基金A类重点项目(6061001)；北京市教委人才强教“学术创新团队”中药方剂研究(5090245)

陈希，博士，从事中兽药相关方面研究。

穆祥,E-mail: muxiang1109@sina.com；许剑琴,E-mail:jianqinxucau@126.com

2015-10-28

A

1002-1280 (2015) 11-0025-05

S853.74