鸡传染性支气管炎病毒AH1/15株S1基因的克隆与序列分析

于雷，张贺楠，张钊伟，程海波，史张燕，周建民

(1.中牧实业股份有限公司农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室，北京 100095；2.乾元浩生物股份有限公司，北京 100083)



鸡传染性支气管炎病毒AH1/15株S1基因的克隆与序列分析

于雷1，张贺楠1，张钊伟1，程海波2，史张燕2，周建民1

(1.中牧实业股份有限公司农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室，北京 100095；2.乾元浩生物股份有限公司，北京 100083)

2015年1月从安徽省某疑似患鸡传染性支气管炎鸡场中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒，命名为AH1/15株，使用特异性引物对AH1/15分离株S1基因进行扩增、克隆及序列测定，并将其与国内外流行株及参考毒株进行比对。结果显示，IBV AH1/15株S1基因全长为1638 bp；同源性分析结果发现，AH1/15株与国内外疫苗毒株核苷酸同源性为57.0%～59.6%；遗传进化分析结果发现，AH1/15株与国内外主要疫苗株以及流行的LX4型毒株亲缘关系较远，与近几年国内分离的CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/SD09/005等毒株亲缘关系最近。结果表明，AH1/15是一株不同于疫苗株和流行株的变异株。

传染性支气管炎病毒；S1基因；序列分析

鸡传染性支气管炎(avian infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病[1]，给养禽业带来巨大经济损失。目前主要采用疫苗接种的方法来预防该病，Mass型疫苗在国内得到了广泛应用，但由于IBV基因组易突变及频繁重组的特点，在传播过程中导致多种基因型及血清型毒株的产生[2]，加之不同血清型之间交叉免疫性很低[3]，这就导致免疫鸡群依然会受IBV野毒的威胁，给我国IB疫情防控带来了极大的困难。由于IBV的S1蛋白在致病性、组织嗜性及宿主细胞的识别和结合方面都有重要作用[4]，同时是中和抗体的主要诱导者[5]，且S1基因型划分与血清学分型具有良好的对应关系[3]，所以常用此基因的遗传进化关系、序列分析来研究IBV的流行趋势。AH1/15株分离自安徽某发病鸡场，本试验对其S1基因进行测序及遗传进化分析，以了解其分子流行病学特征，为该病的防控奠定基础。

1 材料与方法1.1 毒株 IBV AH1/15株来自安徽某发病商品鸡群，由中牧实业股份有限公司研究院分离和保存。

1.2 菌种和载体E.coli感受态细胞DH5α、克隆载体pEASY-T1购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 主要试剂与酶类 Ex Taq酶、DNA Marker、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA Maker Trans2K Plus均购自北京全式金生物技术有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.4 引物设计与合成 根据IBVS1基因两端外的保守序列设计扩增S1全基因的引物，上游引物：GTGTATTTTGACGTTGCTAAG；下游引物：AGCAAAGGTGCCACAAAATG，预期扩增片段大小为1868 bp。引物由北京三博远志公司合成。

1.5 IBVRNA的提取 按照RNA提取试剂盒的使用说明书操作，从鸡传染性支气管炎病毒AH1/15株的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA。

1.6 IBVAH1/15株S1基因的扩增、克隆和测序 以提取的病毒RNA为模板，通过随机引物进行反转录获得cDNA，以合成的cDNA为模板，通过上、下游引物，经PCR扩增S1基因，反应条件为：95 ℃预变性5 min，然后按以下参数(变性：94 ℃ 30 s；退火：53 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 1 min 45 s)进行31个循环，循环结束后72 ℃延伸10 min。将PCR产物与pEASY-T1载体进行连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑选阳性克隆送北京三博远志公司测序。

1.7 S1基因的序列分析 应用DNAStarLasergene 7.0软件对AH1/15株的S1基因测序结果进行拼接，利用MEGALIGN程序的Clustal W方法对分离株和参考毒株的S1基因核苷酸序列进行对比和分析。采用MEGA 4.0软件中Neighbor-Joining(NJ)方法进行遗传演化分析，并绘制系统进化树。分析中涉及的IBV参考毒株及其S1基因GenBank登录号见表1。

表1 参考毒株及其GenBank登录号

2 结果与分析

2.1 IBV S1基因的扩增 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见特异条带，与预期片段大小相符，见图1。

M：Trans2K Plus Marker 1：S1基因的RT-PCR产物 2：阴性对照图1 AH1/15株S1基因的RT-PCR产物

2.2 序列比对结果 测序结果表明，IBV AH1/15株S1基因全长为1638 bp(含裂解位点)；选取具有代表性的国内外毒株及疫苗株进行S1全基因序列比对，结果显示，IBV AH1/15株S1基因核苷酸序列与国内广泛使用的Mass型疫苗株H120、H52的同源性为57.0%和57.1%，与LDT3型tl/CH/LDT3/03毒株同源性为59.6%，与4/91毒株同源性为59.2%，与QX株、LX4株的同源性分别为60.2%和60.3%，与LSC99I毒株同源性为53.5%，与LDL97I毒株同源性为57.3%，与国内外近些年分离的CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/SD09/005ck-CH-LHB-110615、K46/10和K23/10毒株同源性较高，为98.0%～99.3%，其中与CK/CH/GD/CG11同源性最高，为99.3%。以疫苗株H120、M41、4/91和LDT3为参考株，AH1/15、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4和CK/CH/SD09/005S1基因表现为广泛性点突变，多处碱基插入或缺失，且大多具有相同的插入和缺失位点；AH1/15、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4毒株和同源性较高的CK/CH/SD09/005、ck/CH/LHB/110615、K46/10和K23/10相比在S1基因283～285 nt处也有3 碱基缺失。

2.3 以IBV S1全基因为基础的遗传进化分析 利用MEGA4.0软件对AH1/15株和其他参考毒株遗传进化分析并生成系统进化树，见图2。

图2 AH1/15株(▲标记)S1基因与参考毒株核酸系统进化分析

分析结果表明，AH1/15株与参考毒株形成7个进化分支(基因型)。LX4、QX、A2等毒株形成LX4型分支，4/91、7/93B属于4/91型，LNM 05I、LGD 04II等构成CK/CH/LSC/99I型，CH/CH/LDL/97I型包括LDL97I、LDL98I等，国内疫苗株H120、H52、M41和LDT3则分属于Mass型和tl/CH/LDT3/03型。分离株AH1/15株和前6 个分支遗传距离较远，与2007年以来国内和韩国分离株CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/SD09/005、K46/10等形成独立的进化分支。

3 讨论

近年来，通过S1基因分型的方法研究发现，我国同时流行多个IBV基因型的毒株，如LX4型、CK/CH/LSC/99I型、CK/CH/LDL/97I、tl/CH/LET3/03型、Mass型等，其中LX4型是目前流行最为广泛的基因型，比例超过50%，部分地区甚至高达75%[3,6]。

当前，IB仍是困扰我国养鸡业发展的重要疫病之一，临床发病普遍，疫苗免疫预防是控制该病的最为有效的手段之一。目前国内使用疫苗的基因型多为Mass型，但是Mass型毒株只占国内分离毒株的一部分，大部分分离毒株与其遗传距离较远。Mass型的疫苗已经不能对当前流行的LX4型、CK/CH/LSC/99I型等毒株产生完全的免疫保护[7]，因此，研发具有针对性的疫苗显得尤为必要。

AH1/15株与CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11等属于独立的进化分支，与LX4、4/91和Mass基因型毒株遗传距离均较远，其S1基因不仅有较多的碱基突变，而且还有多处碱基插入和缺失。这是2007年以来新出现的一个基因型，TC07-2是首次报道的此类毒株[8]，山东和韩国也先后报道了这一新型IBV流行株[9-10]，提示该类毒株在亚洲地区已经形成一定程度的流行，并且Mass型H120活疫苗不能对该基因型的毒株产生有效的保护[10]，这也就不难解释本研究中的发病鸡场即使进行过系统的传染性支气管炎疫苗免疫，但是仍然感染鸡传染性支气管炎的现象。

因此，我们要对IB进行持续的流行病学监测，同时有必要针对性地选择IB疫苗对分离野毒进行免疫效力评价或研制新型IB疫苗，为IB防控提供科学依据。

[1] Saif Y M．Disease of Poultry[M]．12th Edition．IA：Blackwell Publishing，2008：101-119．

[2] 刘燕．鸡传染性支气管炎病毒分子变异机理和免疫机理的研究进展[J]．中国兽医科学，2006，36(10)：852-856．

[3] 刘胜旺．我国鸡传染性支气管炎流行现状及原因分析[J]．中国家禽，2010，32(16)：5-9．

[4] Wang C H，Huang Y C．Relationship between serotypes and genotypes based on the hyper variable region of the S1 gene of infectious bronchitis virus[J]．ArchVirol，2000，145(2)：291-300．

[5] Cavanagh D，David P J，Cook J K A，etal．Location of the amino acid differences in theS1 spike glycoprotein subunit of closely related serotypes of infectious bronchitis virus[J]．Avian Pathol,1992，21(1)：33-43．

[6] Han Z，Sun C，Yan B，etal．A 15-year analysis of molecular epidemiology of avian infectious bronchitis coronavirus in China[J]．Infect Genet Evol，2011，11(1)：190-200．

[7] 张小荣，程小果，张建军，等．H120活疫苗对部分基因型传染性支气管炎病毒的免疫保护效力[J]．扬州大学学报：农业与生命科学版，2011，32(3)：1-5．

[8] Li L，Xue C，Chen F，etal．Isolation and genetic analysis revealed no predominant new strains of avian infectious bronchitis virus circulating in South China during 2004-2008[J]．Vet Microbiol，2010，143(2-4)：145-154．

[9] 胡北侠，杨少华，许传田，等．2008-2012年山东省鸡传染性支气管炎病毒遗传演化分析和致病性研究[J]．畜牧兽医学报，2014，45(5)：795-801．

[10]Lim T H，Kim M S，Jang J H，etal．Live attenuated nephro-pathogenic infectious bronchitis virus vaccineprovides broad cross protection against new variant strains[J]．Poult Sci，2012，91(1)：89-94．

(编辑：李文平)

Cloning and Sequence Analysis of S1Gene of Avian Infectious Bronchitis Virus AH1/15 Strain

YU Lei, ZHANG He-nan, ZHANG Zhao-wei, CHENG Hai-bo2, SHI Zhang-yan2, ZHOU Jian-min

(1.ChinaAnimalHusbandryIndustryCo.,Ltd,KeyLaboratoryofBiologicalProductsandChemicalDrugsforAnimals,MinistryofAgriculture,Beijing100095,China; 2.QYHBiotechCompanyLimited,Beijing100083,China)

One infectious bronchitis virus (IBV) was isolated from Anhui province, named as AH1/15 isolate.S1 gene of the strain was amplified, cloned and sequenced.The S1gene of the strain was composed of 1638 base pairs, the nucleotide acid similarities among the vaccine strains and the AH1/15 strain were57.0%～59.6%.The genetic evolution analysis showed that AH1/15 strain had far relationship with the vaccine strains andLX4 type strains, but showed the closest relationship with the strains which isolated in recent years, such as CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11 and CK/CH/SD09/005.The result showed that the variant IBV AH1/15 was different from vaccine and epidemic strains.

infectious bronchitis virus；S1 gene；sequence analysis

于雷，硕士，执业兽医师，从事兽用生物制品研发工作。E-mail：sgyulei@sohu.com

2015-08-25

A

1002-1280 (2015) 11-0017-04

S852.65