一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测

李文婷，闫恕，张丹丹，贾博岩，唐艳，孔令聪，

裴志花1，刘树明1，马红霞1,2*



一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测

李文婷1，闫恕1，张丹丹1，贾博岩1，唐艳1，孔令聪1，

裴志花1，刘树明1，马红霞1,2*

(1.吉林农业大学,动物科学技术学院，长春 130118；2.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林农业大学，长春 130118)

利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Muscadomesticaantimicrobial peptide,MDAP-2)，为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列，采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因，构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2，将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内，将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达，并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小，经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白，采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示，重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达，蛋白分子量为7.8 kD，管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。

家蝇抗菌肽(MDAP-2)；毕赤酵母；分泌表达；抑菌活性

家蝇(Muscadomestica)常生活在多种病原菌孳生的环境中而自身很少染病，这缘于其体内外抗菌活性物质作用的结果[1]，抗菌肽作为家蝇体内强效的抗菌活性物质之一，其可抑杀多种致病菌、病毒、原虫，且对正常生物体细胞无破坏作用[2]。因此，本课题组成功克隆得到新型家蝇抗菌肽MDAP-2的核苷酸序列，其开放阅读框(ORF)198 bp，Genbank登录号(KJ787648)，与Genbank上其它抗菌肽基因均不具有同源性，其原核表达产物对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌均有体外抑菌活性[3]。由于原核表达系统缺少蛋白翻译后修饰和加工，如空间结构的正确折叠，糖基化等特点，很难表达出具有天然活性的抗菌肽，如果用其作为抗菌物质应用于临床，后期处理工序较为复杂，导致生产成本大幅度增高[4]，使得抗菌肽的临床应用受到一定限制。而毕赤酵母表达系统的优点在于酵母菌是真核生物，与动物细胞一样具有转录、翻译后加工修饰的功能，表达出的抗菌肽具有天然活性，并且抗菌肽对酵母的杀伤力较弱，发酵生产的抗菌肽不必进行复杂的分离纯化[5]，因此，本研究采用PCR技术扩增MDAP-2全长序列对其进行真核表达，并对表达产物进行生物学活性分析，为开发出新一代高效、无毒、不耐药可应用于临床的抗菌药物提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 文库及菌株、表达载体 致病性沙门氏菌诱导家蝇幼虫cDNA文库，3’RACE-Ready cDNA由吉林农业大学兽医药理实验室完成[6]；实验菌株E.ColiDH5α、P.pastoris受体菌GS115、表达载体pPIC9K均由吉林农业大学兽医药理实验室保存；克隆载体pMD18-T，大连Takara有限公司。

1.1.2 主要试剂 ExTaqTMDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ、DL 2000TMDNA Marker、λ-HindⅢ digest DNA Marker等，大连TaKaRa有限公司；Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、超低分子量蛋白Maker，北京索莱宝生物公司；抗生素G418，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.2MDAP-2全长基因扩增及克隆 以3’RACE-Ready cDNA为模板，P1、P2为引物进行PCR反应。反应体系(25 μL)：模板1 μL，P10.5 μL，P20.5 μL，dNTP1 μL，Taq 酶0.3 μL，10×缓冲液2.5 μL，去离子水19.7 μL。反应条件：95 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃总延伸10 min，循环次数为32次。

PCR产物回收后与pMD18-T克隆载体连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，重组质粒用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切验证为阳性，送生物公司测序并进行序列分析。该重组质粒命名为pMD18-T-MDAP-2。

1.2.3 重组表达载体pPIC9K-MDAP-2的构建用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pMD18-T-MDAP-2重组质粒和pPIC9k表达载体，胶回收MDAP-2基因片段和pPIC9k载体片段，连接并转化至E.coliDH5α感受态细胞，提取质粒进行双酶切(EcoRⅠ和NotⅠ)鉴定，将获得的阳性质粒送生物公司测序并进行序列分析。将重组质粒命名为pPIC9K-MDAP-2。

1.2.4 pPIC9K-MDAP-2质粒转化毕赤酵母 将10 μL经SacI限制性内切酶线性化后的pPIC9K-MDAP-2的质粒，用电穿孔法(1500 V、25 μF、200 Ω、4 ms)转入P.Pastoris(GS115)细胞并涂布在YPD平板上，pPIC9K 质粒含有卡那霉素抗性基因，其转染的宿主菌能抗氨基糖甙类抗生素(G418)。本研究采用含不同浓度G418的YPD平板来筛选高拷贝转化子，30℃培养至单菌落出现。

1.2.5 重组酵母的PCR鉴定 将筛选后的高拷贝转化子挑取单菌落活化至YPD培养基中，30 ℃培养24 h，提取P.pastoris重组菌基因组，PCR鉴定阳性重组酵母菌。PCR条件如下：95 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃总延伸10 min，循环次数为32次。

1.2.6MDAP-2基因的诱导表达、表达产物 Tricine-Tris-SDS-PAGE分析划线接种阳性重组酵母菌于含125 μg/mL的G418的YPD平板上，30 ℃温箱培养24 h,挑取单菌落接种于5 mL BMGY培养基中，30 ℃摇床(250 r/min)培养 24 h，离心，去上清，转接部分菌体至50 mL BMMY培养基中，使OD值达到1，随即加入500 μL 5%甲醇进行诱导表达,每隔24 h补加500 μL 5%甲醇,120 h后诱导表达结束。同时以pPIC9K空载体质粒转入P.pastoris(GS115)细胞的阳性重组菌在相同条件下诱导表达作为阴性对照。于24、48、72、96 h分别取1 mL菌液样品，分离样品，上清液经TCA浓缩[7]后加入灭菌水20 μL及20 μL的2×Tricine蛋白上样缓冲液，沸水裂解10 min，用Tricine-Tris-SDS-PAGE测定表达产物的相对分子量。

1.2.7 重组蛋白的纯化及其的活性鉴定 通过镍柱纯化后的蛋白进行Tricine-Tris-SDS-PAGE检测纯化产物，并用管碟法[8]鉴定纯化产物的抑菌活性。取100 μL菌液(105CFU/mL)均匀涂布于LB平板上，放入牛津杯，杯内加入50 μL纯化后的蛋白，37 ℃培养12 h左右，观察有无抑菌环出现，并检测抑菌环大小。

2 结果2.1 MDAP-2全长基因的扩增及克隆 MDAP-2基因PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可观察到大小为216 bp的目的条带(图1) 。通过双酶切鉴定以及序列测序结果表明，PCR产物即为 MDAP-2基因的全长(图2)。

M：DL2000 DNAMaker；1：MDAP-2全长基因扩增片段图1 MDAP-2全长基因的扩增结果

M：DL2000 DNAMaker；1：pMD-18T-MDAP-2重组质粒双酶切图2 pMD-18T-MDAP-2重组质粒的双酶切鉴定(EcoRⅠ，NotⅠ)

2.2 重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2的构建和其线性化结果 通过双酶切(图3) 鉴定时出现大小为216 bp左右的一条清晰条带，与目的基因的大小基本相符，序列测定结果正确表明重组表达质粒pPIC9k-MDAP-2构建成功。pPIC9k-MDAP-2线性化结果可见大小在9300 bp左右有单一的清晰条带，表明线性化成功(图4)。

M1：λ-HindⅢ Marker；M2：DL2000 DNAMaker；1：pPIC9k-MDAP-2重组质粒双酶切(EcoRⅠ，NotⅠ)图3 pPIC9k-MDAP-2重组质粒的双酶切鉴定

2.3 PCR鉴定重组酵母菌 通过G418筛选出高拷贝的转化子，提取pPIC9k-MDAP-2重组酵母菌基因组，以其为模板，以P1和P2为引物进行PCR 扩增，扩增出正确条带(216 bp) (图5) ，说明pPIC9k-MDAP-2稳定整合到P.pastoris(GS115)的染色体中。

M：λ-HindⅢ Marker；1：pPIC9k-MDAP-2线性化产物图4 pPIC9k-MDAP-2重组质粒线性化结果

M：DL2000 DNAMaker；1：pPIC9k-MDAP-2重组酵母菌图5 GS115-pPIC9k-MDAP-2重组酵母菌PCR鉴定结果

2.4 pPIC9k-MDAP-2重组质粒诱导表达产物Tricine-Tris-SDS-PAGE分析 pPIC9k-MDAP-2重组质粒诱导表达产物的分子量约为7.8 kD，理论上，分子量低于15 kD的多肽在常规Tris甘氨酸电泳系统中难以得到理想的电泳分辨率。因此使用Tricine(三羟甲基氨基甘氨酸) 代替甘氨酸作为终止离子，使其得到较好的分辨率。在72 h时经甲醇诱导蛋白可见表达，在96 h时蛋白表达条带较为明显(图6)。以96 h经甲醇诱导的pPIC9K空载体重组酵母菌作为对照。

M：超低分子量蛋白Maker；1：pPIC9k-MDAP-2重组质粒诱导表达产物(72h)；2：pPIC9K空载体诱导表达产物；3：pPIC9k-MDAP-2重组质粒诱导表达产物(96h)图6 pPIC9k-MDAP-2重组质粒诱导表达产物Tricine-Tris-SDS-PAGE分析

2.5MDAP-2重组蛋白的纯化 纯化后的蛋白进行Tricine-Tris-SDS-PAGE检测，得到一条单一的分子量为7.8 kD的蛋白条带(图7)。

M：超低分子量蛋白Maker；1：纯化后的MDAP-2重组蛋白图7 纯化后MDAP-2重组蛋白Tricine-Tris-SDS-PAGE分析

1：MDAP-2纯化后重组蛋白；N：洗脱液图8 纯化后MDAP-2重组蛋白对大肠杆菌

1：MDAP-2纯化后重组蛋白；N：洗脱液图9 纯化后MDAP-2重组蛋白对沙门氏菌抑菌活性检测

2.6MDAP-2重组蛋白的抑菌活性检测 采用管碟法对纯化后的MDAP-2重组蛋白进行抑菌活性检测，结果显示MDAP-2重组蛋白对大肠杆菌有抑菌活性(图8)，且对沙门氏菌具有抑菌活性(图9)，均以纯化洗脱液为对照。

3 讨论

采用毕赤酵母表达系统对新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因进行了表达，发酵过程中外源蛋白产率受到多方面影响如遗传因素和培养条件，本研究采用序列优化的方法，添加增强真核基因翻译效率的kozak序列，并采用分批培养的方法，较连续培养相比其优势在于可以达到较高的细胞密度且便于控制。结果表明，经过优化的序列以及严格的控制培养条件使MDAP-2获得高效表达。在对MDAP-2进行体外抑菌活性检测时，为排除酵母发酵产生乙醇的干扰将上清液冻干后用无菌水溶解，结果发现其表达产物对大肠杆菌、沙门氏菌均具有较高的抑菌活性，说明经过真核表达修饰加工后具有天然N端的家蝇抗菌肽MDAP-2蛋白接近于天然蛋白的构象，具有较高的生物学活性。真核生物细胞膜表面大量的胆固醇和膜蛋白，使其趋于稳定, 可抵御抗菌肽的杀细胞作用，这就决定了抗菌肽对正常的真核细胞的生长没有影响[9]，因此，家蝇抗菌肽MDAP-2对酵母细胞的杀伤力较弱，其表达效率较高，发酵生产的抗菌肽不必进行复杂的分离纯化，可以直接作为饲料添加剂应用于临床，具有更为广泛的应用前景。

近年来，毕赤酵母表达系统得到了优化，Wu等[10]利用AOX1和GAP启动子组合共表达重组蛋白表达效率会比单独使用AOX1启动子高约两倍；王慧等[11]利用双质粒共表达体系提高融合蛋白在毕赤酵母中的表达量；付玲等[12]优化了pPIC9k表达载体，弥补了一些常用载体的不足之处，无论在克隆方式还是在对外源蛋白的分泌表达提高方面都有一定的改进。今后研究中，可根据毕赤酵母的偏嗜性优化密码子、应用AOX1和GAP启动子组合共表达重组蛋白等方法来提高MDAP-2蛋白的表达量，为家蝇抗菌肽MDAP-2应用于临床进行进一步摸索。

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(编辑：陈希)

Eukaryotic Expression of a Novel Antimicrobial Peptide Gene (MDAP-2) fromMuscadomesticaLarvae and Its Antibacterial Activity

LI Wen-ting1, YAN Shu1, ZHANG Dan-dan1, JIA Bo-yan, TANG Yan1, KONG Ling-cong1, PEI Zhi-hua1, LIU Shu-ming1, MA Hong-xia1,2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.AnimalProduction&ProductQualityandSecurityoftheMinistryofEducation,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Pichiapastorisexpression system was applied to express a novel antimicrobial peptideMDAP-2 gene fromMuscadomestica, which provide experimental evidence forMDAP-2 used as a new antimicrobial substance in clinical application.Based on the amino acid sequence of antibiotical peptideMDAP-2, which was previously identified, polymerase chain reaction (PCR) technique was performed to amplified theMDAP-2 gene, and eukaryotic recombinant expression plasmid pPIC9K-MDAP-2 was constructed, subsequently the recombinant plasmid was digested used to transformed thePichiapastoris(GS115 cells) through electroporation.The positive recombinant pPIC9k-MDAP-2 which detected by PCR induced by addition of methanol, using tricine-SDS-PAGE detected the weight of recombinantMDAP-2 protein.The recombinantMDAP-2 was purified using Ni-NTA HisTrap FF crude column chromatography and the bacteriostatic activity of the recombinant purifiedMDAP-2 protein was assessed by tube plate method.The test results showed that the molecular weight of recombinantMDAP-2 protein was about 7.8 kD,MDAP-2 had in vitro antibacterial activity againstEscherichiacoliandSalmonellapullorum.TheMDAP-2 gene was expressed successfully inPichiapastorisexpression system which provide reference for further research in the biological and immunologic activities ofMDAP-2.

MuscadomesticaMDAP-2;Pichiapastoris; secretory expression; antibacterial activity

国家自然科学基金资助项目(31140026，31572574，31502121)；吉林省世行贷款农产品质量安全项目(2011-Y05)

李文婷，硕士研究生，从事动物药理和毒理学研究。

马红霞。E-mail：hongxia0731001@163.com

2015-07-23

A

1002-1280 (2015) 11-0011-06

S852.6