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鼠伤寒沙门菌cpx R 基因缺失株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

2015-03-09田亚凯孙亚伟陈丽鹏刘建华崔耀明胡功政

中国预防兽医学报 2015年10期
关键词:沙门同源耐药性

黄 慧,田亚凯,孙亚伟,陈丽鹏,苑 丽,刘建华,崔耀明,胡功政*

(1.河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州 450002;2.河南科技学院,河南 新乡 453001;3.河南牧业经济学院,河南 郑州 450011)

沙门菌(Salmonella)属于人畜共患病原菌,由于抗生素长期和广泛的使用,其耐药性产生已成为严重威胁公共卫生的问题。研究发现,双组分信号转导系统(TCS)与细菌的致病性、耐药性关系密切,被认为是具有应用潜力、可降低耐药性和毒力的抗菌作用新靶点[1]。CpxAR 系统是革兰氏阴性菌中普遍存在的TCS 之一,它由细胞膜组氨酸蛋白激酶CpxA、细胞质应答调节蛋白CpxR 以及细胞周质空间辅助调节蛋白CpxP 构成[2],其中应答调节蛋白CpxR 含有多个可以与不同DNA 序列特异性结合的位点,可以有选择的上调或下调基因转录从而调控细菌的生命活动[3]。研究显示CpxAR 对β-内酰胺环类抗生素如头孢曲松(CRO)等的耐药性具有调控作用[4],可赋予肺炎克雷伯菌对头孢吡肟(FEP)和氯霉素(CHL)的抗性[5]。大肠杆菌的CpxAR 系统可上调外膜蛋白OmpC 的表达量、下调OmpF 的表达量[6]。但CpxAR 具体对细菌的哪些耐药基因具有调控作用及其调控机制均有待阐明。

本研究采用Red 重组系统[7],对鸡源鼠伤寒沙门菌cpx R 基因进行敲除,初步分析cpx R 缺失后鼠伤寒沙门菌对抗菌药物的敏感性变化,为进一步研究CpxAR 对沙门菌多重耐药性的调控机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株与质粒 鸡源鼠伤寒沙门菌标准菌株CVCC541(以下称为JS)购自中国兽医药品监察所;E.coli ATCC®25922 质控菌购自中国普通微生物菌种保存中心;含有两侧带有FRT 位点的卡那霉素抗性(kanr)基因的pKD4 质粒、具有温度敏感复制子及表达Gam、Bet 和Exo 3 种噬菌体重组酶的pKD46质粒、具有温度敏感型复制子及表达FLP 重组酶的pCP20 质粒均由本实验室保存;pBAD 原核表达质粒购自上海北诺生物科技有限公司。

1.2 主要试剂 各种细菌培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司;质粒小量提取试剂盒购自美国OMEGA 公司;DNA Marker 购自北京Biomed 公司;PrimerSTAR Max Premix(2×)购自TaKaRa 公司;pGEM-T 载体购自Promega 公司;DNA 胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司;各种抗菌药物均为国产原料药,符合中国药典或中国兽药典质量标准;PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 引物设计 根据GenBank 中登录的鼠伤寒沙门菌cpx R 基因全序列(HG326213.1),利用Primer 5.0 软件设计3 对特异性引物,其中Lc-F/Lc-R 为cpx R 基因敲除引物(其5' 末端的部分序列与cpx R 两侧序列同源,靠近3' 末端的部分序列与质粒pKD4中kanr基因两侧序列互补),用于PCR 扩增同源重组敲除cpx R 基因的打靶DNA 片段;Cr-F/Cr-R 为cpx R 敲除鉴定引物(Cr-F 位于cpx R 上游32 bp 的cpx A 基因内,Cr-R 位于cpx R 下游33 bp 的cpx P 基因内),用于检测cpx R 缺失突变株;K1/K2 位于kanr基因内部,用于检测插入的kanr基因;引物组合Cr-F/K2 和K1/Cr-R 用于验证kanr基因的插入位置。引物序列见表1。

1.4 cpx R 基因缺失株的构建

1.4.1 同源重组打靶DNA 片段制备及鉴定 以pKD4 质粒为模板,利用Lc-F/Lc-R 引物扩增出两侧带有FRT 位点的kanr基因及cpx R 两侧同源臂的PCR 产物(线性打靶DNA 片段)。并将PCR 产物克隆至pGEM-T 中进行测序鉴定。

1.4.2 cpx R 基因Red 同源重组 将编码Red 重组系统的pKD46 质粒电转化至JS 中制备JS/pKD46,将线性打靶DNA 片段电击转化入经10 mmol/L 的L-阿拉伯糖诱导后的JS/pKD46 中,在kanr的LB 平板上筛选重组菌JS△cpx R::kan/pKD46。利用Cr-F/R、Cr-F/K2、K1/Cr-R 和K1/K2 4 对引物进行PCR扩增验证,并测序鉴定。

1.4.3 pKD46 和kanr基因的消除 将鉴定正确的JS△cpx R::kan/pKD46 接种于无抗生素的LB 培养液中,42 ℃培养6 h 消除pKD46,再在LB 琼脂 平板上37 ℃过夜培养。挑取单菌落分别置于kanr和Ampr的LB 肉汤中培养,筛选出仅有kanr的cpx R缺失菌JS△cpx R::kan。将pCP20 质粒电转化入JS△cpx R::kan 中,30 ℃培养在Ampr平板上筛选阳性菌落,并将其接种于无抗性LB 肉汤培养液中,42 ℃震荡培养6 h 以删除kanr基因,37 ℃划线培养筛选无Ampr和kanr的重组菌(JS△cpx R)。以其基因组DNA 为模板,以Cr-F/R 为引物进行PCR 鉴定并测序。

1.5 JS △cpx R 回补株的制备 以JS 基因组DNA为模板,利用引物cpxR-F/R 扩增cpx R 的完整ORF,PCR 产物经回收纯化后克隆至pBAD 载体中构建重组表达质粒pBAD-cpx R,由华大基因公司进行测序鉴定。将构建的pBAD-cpx R 电转化入JS△cpx R 中,在Ampr平板上筛选阳性重组回补株JS △cpx R/p cpx R。

表1 本研究中所用到的引物Table 1 The primers used in this study

1.6 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用微量肉汤稀释 法[8]测 定JS、JS△cpx R 和JS△cpx R/p cpx R 对12种抗菌药物的MIC 值,试验重复3 次,结果取平均值。

2 结果

2.1 同源重组打靶DNA 片段的扩增及鉴定 以pKD4 质粒为模板,利用引物Lc-F/R 进行PCR 扩增,结果显示扩增产物约为1 600 bp,将其克隆于pGEM-T 载体中,经SacⅠ酶切后得到一条约4 600 bp的目的片段,经NotⅠ酶切后得到预期的两条片段:载体片段(约3 kb)和PCR 产物(图1)。测序结果表明,该cpx R 基因的打靶DNA 序列为两端带有cpx R两侧同源臂的kanr基因表达盒序列,与预期大小(1 607 bp)一致。

图1 同源重组打靶DNA 片段的鉴定Fig.1 Identification of the DNA fragment for homologous recombination

2.2 cpx R 基因Red 同源重组 将pKD46 质粒电转化于JS 株中构建重组菌JS/pKD46,再将同源重组打靶DNA 片段电击转化于JS/pKD46 中,使其通过同源重组替换JS 株中的cpx R 基因,并在kanr平板上筛选得到cpx R 基因缺失重组菌,利用引物Cr-F/R、K1/K2、Cr-F/K1、K2/Cr-R 进 行PCR 鉴 定,结果显示,均出现预期大小的目的片段(图2)。同时测序结果也证明在JS△cpx R::kan/pKD46 中cpx R 被kanr基因替换敲除。

图2 菌株JS△cpx R::kan 中cpx R 基因被kanr 基因替换的鉴定Fig.2 Identification of cpx R gene replaced with kanr gene in strain JS△cpx R::kan by PCR

2.3 质粒pKD46 和kanr基因的消除 将JS△cpx R::kan/pKD46 于42 ℃培养以消除pKD46。挑取单菌落分别置于kanr和Ampr的LB 中,结果显示JS△cpx R::kan 仅能在kanr的LB 培养基中生长,而不能在Ampr的LB 中生长,表明质粒pKD46 被消除。将pCP20 质粒电转化于缺失菌JS△cpx R::kan 后,经30 ℃培养筛选到Ampr转化子,经42 ℃升温培养获得在Ampr和kanr平板上均不生长的重组菌JS△cpx R。经PCR 鉴定,得到与预期一致的大小约为230 bp 的目的片段(图3)。测序结果显示kanr基因从染色体中消除,仅剩83 bp 的残留FRT 位点,表明cpx R 基因缺失株JS△cpx R 构建正确。

图3 菌株JS△cpx R 中kanr 基因消除的PCR 鉴定Fig.3 Identification of kanr gene deletion in strain JS△cpx R by PCR

2.4 回补菌株JS △cpx R/p cpx R 的构建 将cpx R的完整ORF 扩增后克隆于L-阿拉伯糖剂量依赖型载体pBAD 中,构建重组表达质粒pBAD-cpx R,将其电转化于JS△cpx R 后获得回补菌株JS△cpx R/p cpx R。

2.5 药敏试验结果 以对所有药物均敏感的质控菌E.coli ATCC®25922 为对照进行药物敏感性试验。结果显示,在所测定的12 种药物中,缺失株JS△cpx R 与亲本株JS 相比,对氨基糖苷类和β-内酰胺类药物的敏感性升高,庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、头孢噻呋(CEF)和头孢曲松(CRO)对JS△cpx R 的MIC 值与亲本株JS 相比分别降低了4、4、4 和2 倍;而回补菌株JS△cpx R/p cpx R 对这4 种药物的敏感性随着诱导剂L-阿拉伯糖浓度的升高逐渐恢复到亲本株JS 的水平,呈诱导剂量依赖关系。当L-阿拉伯糖为最大浓度0.5 %时,4 种药物的MIC 值与缺失菌JS△cpx R 相比分别升高了16、8、8 和16 倍,同时发现氟苯尼考(FFC)的MIC 值也升高了4 倍,而其他药物的MIC 值未出现明显变化(表2)。

表2 cpx R 基因缺失株对12 种临床常用代表药物敏感性检测(MIC)Table 2 The susceptibilities of cpx R deleted strain to 12 antibiotics

3 讨论

目前已发现cpx R 可以调控大肠杆菌对氨基糖苷类的Kan 和β-内酰胺环类部分药物的耐药性[9-10],TCS BaeSR 可以调控沙门菌的多重耐药性[11],而CpxAR 可增强TCS BaeSR 对外排泵acr D、mdt ABC的表达的上调作用,另外CpxAR 还可调控鼠伤寒沙门菌对AMK 的耐药性[12]。以往关于多重耐药性调控作用的研究主要是利用RT-PCR 方法分析临床分离多重耐药性菌耐药基因及外排泵基因或调控基因的表达水平[13],或将cpx R 在大肠杆菌中过表达来正向观察cpx R 对耐药性的调控作用[10]。而本研究是通过比较鼠伤寒沙门菌标准菌株cpx R 基因敲除前后对抗菌药物敏感性的变化来反向研究cpx R 对多重耐药性的调控作用。结果显示cpx R 可以至少调控鼠伤寒沙门菌对氨基糖苷类的GEN 和AMK 以及β-内酰胺类的CEF 和CRO 的耐药性,同时也发现菌株对药物的敏感性与cpx R 的表达量密切相关,呈剂量依赖性关系。而在本实验中,CRO 对标准菌cpx R 缺失株的MIC 降低幅度(2 倍)远低于Hu 等在CRO 耐药沙门菌的cpx R 缺失株中观察到的降低幅度(2 048 倍)[4],这可能与其亲本菌的CRO 高耐药性有关。另外,高浓度诱导剂诱导使回补菌株大量表达靶蛋白CpxR 时,菌株对FFC 的敏感性也有所升高,表明cpx R 可能也调控鼠伤寒沙门菌对FFC 的敏感性,但有待进一步实验验证。

沙门菌的9 个功能性药物外排泵中acr B 是多重耐药性形成最重要的外排泵。研究表明acr B、acr D和acr F 是被协调调控的,acr B 的存在和表达会掩盖其他两种外排泵的作用[13],因此本实验中cpx R 对多重耐药性的调控作用可能会因为acr B 的存在而未完全表现。有研究证实acr D 是调控大肠杆菌对氨基糖苷类药物敏感性的重要外排泵[14],大肠杆菌对β-内酰胺类药物的敏感性主要受依赖TolC 的5 种RND家族外排系统的协调调控[15],并且已发现cpx R 可以调控沙门菌外膜蛋白的表达量[12]。因此,cpx R 对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控作用可能与其调控外排泵acr AD 及外膜蛋白的表达量有关。要深入研究cpx R 对多重耐药性的调控机制,应进一步在acr B基因缺失株中观察cpx R 的调控作用,本研究通过构建鼠伤寒沙门菌cpx R 缺失株确证了cpx R 对鼠伤寒沙门菌多重耐药性具有重要调控作用,为下一步构建cpx R 和acr B 双基因缺失株研究CpxAR 对沙门菌多重耐药性的调控机制提供了基础性实验材料。

[1]Stephenson K,Hoch J A.Virulence-and antibiotic resitanceassociated two-component signal transduction systems of Grampositive pathogenic bacteria as targets for antimicrobial therapy[J].Pharmacol Ther,2002,93:293-305.

[2]Hunke S,Keller R,Muller V S.Signal integration by the Cpx-envelope stress system[J].FEMS Microbiol Lett,2012,326:12-22.

[3]徐乐,周晓辉,何晓亮.革兰氏阴性菌的Cpx 双组分调控系统[J].微生物学报,2014,54(3):269-275.

[4]Hu W S,Chen H W,Zhang Rui-yang,et al.The expression levels of outer membrane proteins STM1530 and OmpD,which areinfluenced by the CpxAR and BaeSR two-component systems,play important roles in the Ceftriaxone resistance of Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(8):3829-3837.

[5]Srinivasan V B,Vaidyanathan V,Mondal A,et al.Role of the two component signal transduction system CpxAR in conferring Cefepime and Chloramphenicol resistance in Klebsiella pneumonia NTUH-K2044[J].PLoS ONE,2012,7(4):e33777.

[6]Batchelor E,Walthers D,Kenney J L,et al.The Escherichia coli CpxA-CpxR envelop stress response system regulates expression of the porins OmpF and OmpC[J].J Bacteriol,2005,187(16):5723-5731.

[7]朱春红,孙晓庆,何素芬,等.基于Red 同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌突变株方法的比较[J].中国预防兽医学报,2009,31(2):81-84.

[8]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing[S].

[9]Hirakawa H,Nishino K,Hirata T,et al.Comprehensive studies on the drug-resistance mediated by the overexpression of response regulators of two-component signal transduction systems in Esherichia coli[J].J Bacteriol,2003,185(6):1851-1856.

[10]Hirakawa H,Nishino K,Yamada J,et al.β-Lactam resistance modulated by the overexpression of response regulators of twocomponent signal transduction systems in Esherichia coli[J].J Antimicrob Chemother,2003,52:576-582.

[11]Spectoral M P,Kenyon W J.Resistance and survival strategies of Salmonella enterica to environmental stress[J].Food Res Int,2012,45:455-481.

[12]Humphreys S,Rowley G,Stevenson A,et al.Role of the twocomponent regulator CpxAR in the virulence of Salmonella enterica serotype Typhimurium[J].Infect Immun,2004,72(8):4654-4661.

[13]Deborah J E,Laura J V P,Vito R.Expression of acr B,acr F,acr D,mar A,and sox S in Salmonella enterica serovar Typhimurium:role in multiple antibiotic resistance[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(4):1145-1150.

[14]刘建华,苑丽,胡功政,等.氨基糖苷类耐药鸭大肠杆菌acr D 基 因mRNA 表达水平[J].中国兽医学报,2011,31(6):814-818.

[15]Akihito Y,Kunihiko N,Junko Y,et al.Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-Lactams[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(9):3030-3033.

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