H5N1 禽流感病毒以巨胞饮作用侵入细胞的研究

田 雨，陈普成，赵玉辉，姜永萍，柳金雄，陈化兰

(中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001)

禽流感病毒(Avian influenza viruses，AIV)属于正粘病毒科流感病毒属，病毒基因组分为8 个节段，全长约13.6 nt，编码至少10 种蛋白：PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2、NS1 和NS2。H5N1 亚型AIV 为高致病性AIV(HPAIV)，其感染能够导致禽类的高死亡率，同时也严重的危害人类的健康[1]。

一般认为，网格蛋白(Clathrin)和小窝蛋白(Caveolae)分别介导的两种内吞途径为流感病毒侵入细胞的主要方式[2]。这两种内吞途径均依赖于GTP蛋白激酶Dynamin 2[3]。Dynasore 是最新发现的针对Dynamin 蛋白的非竞争性抑制剂，能够抑制网格蛋白和小窝蛋白介导的病毒侵入[4]。然而，在胎牛血清的存在的体外病毒培养条件下，Dynasore 仍然可以抑制只通过网格蛋白介导的水疱性口炎病毒(VSV)侵入，表明胎牛血清并未导致Dynasore 失活[5]。

巨胞饮(Macropinocytosis)是细胞在某些因素刺激下，细胞膜皱褶形成大且不规则的原始内吞小泡，非选择性地内吞细胞外营养物质和液相大分子的过程[6]。研究表明，5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)能够特异性抑制巨胞饮作用[7]。

作为亲本病毒，H5N1 亚型AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)具有禽源和人源SAα2,3Gal/SAα2,6Gal受体的双重亲和性。然而，通过其HA 蛋白Q226L 和G228S 点突变的重组病毒rDK35/HA-Q226L/G228S，或HA 蛋白经A160T 点突变的重组病毒rDK35/HA-A160T则仅具有SAα2,6Gal 人源受体亲和性，或仅具有SAα2,3Gal 禽源受体结合[8-9]。

本研究利用Dynasore 抑制通过网格蛋白和小窝蛋白介导的病毒侵入方式，在体外胎牛血清(FBS)存在的情况下，证明流感病毒可以通过巨胞饮方式进入细胞，即FBS 能够诱导H5N1 亚型AIV 通过巨胞饮方式进入细胞，为进一步研究体内AIV 感染细胞的机理提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株及细胞 DK/35(禽源和人源受体双重亲和性)、rDK35/HA-Q226L/G228S(人源受体亲和性)和rDK35/HA-A160T(禽源受体亲和性)由本实验室构建；鸡成纤维细胞系(DF1)、犬肾传代细胞系(MDCK)、人肺癌细胞系(A549)由本实验室保存。

1.2 主要试剂 细胞培养液DMEM、F-12K、opti-MEM 购 自Gibco 公 司；FBS 购 自Biochrom 公司；Dynasore、EIPA 购自Sigma 公司；神经 氨酸苷酶购自NEB 公司；FITC 标记的山羊抗兔IgG(FITC-IgG)购自Millipore 公司；抗AIV NP 多克隆抗体(PcAb)为本实验室制备；生物素-链霉亲和素封闭试剂盒、生物素标记的与SAα2,3Gal 结合的山槐凝集素(MAA I 与 MAA II)及 FITC 标记的与SAα2,6Gal 结合的接骨木凝集素(SNA)均购自Vector公司；DyLight 594 标记的链霉亲和素、红色荧光素NHS-Rhodamine 标记试剂盒购自Thermo scientific 公司。

1.3 间接免疫荧光(IFA)及流式细胞术(FCM)将染毒16 h 后的细胞采用PBS 清洗3 次，加入4 %的多聚甲醛室温固定20 min，弃去固定液，加入1 %BSA 室温封闭30 min。以抗NP 血清为一抗(1∶200)，IgG-FITC 作为二抗(1∶500)。通过荧光显微镜观察，通过流式细胞仪测定荧光量。

1.4 Dynasore 工作浓度确定 将Dynasore 以细胞培养液F-12K 配制成不同浓度梯度的溶液，分别加入6 孔板中培养的A549 细胞单层，37 ℃孵育30 min后置于冰上10 min，将0.5 MOI 的DK/35 感染A549细胞，2 h 后去除上清，再次换入不同浓度的Dynasore 溶液。16 h 后通过IFA 检测感染数量确定最佳工作浓度。

1.5 病毒在Dynasore 作用下的侵入试验 将DK/35 纯化灭活后，使用NHS-Rhodamine 标记试剂盒进行标记，感染A549 4 h 后，固定，染核，通过共聚焦显微镜观察病毒定位情况。

1.6 FBS 对Dynasore 作用的影响 将上述试验中的F-12K 纯培养液加入10 %的FBS 后按照最佳浓度重复上述1.4 中的实验步骤，16 h 后进行IFA 鉴定，取上清测定病毒TCID50。

1.7 EIPA 对于巨胞饮作用的影响 将Dynasore 的F-12K(10 % FBS)溶液加入浓度为75 μM 的EIPA，重复1.4 中实验步骤，2 h 后换液时去除EIPA，16 h后采用NP 蛋白的IFA，进行鉴定。

1.8 MDCK、DF1 的巨胞饮方式的验证 分别采用MDCK、DF1 细胞采用最佳工作浓度重复1.4 的实验步骤，分别DMEM、10%血清的DMEM、Dynasore+DMEM、Dynasore+10 %血清的DMEM 重复上述实验，16 h 后进行IFA 鉴定。

1.9 A549 细胞表面α-2,3、α-2,6 受体的鉴定将形成单层的细胞经4 %多聚甲醛固定20 min，以生物素、链霉素分别封闭15 min，加入MAAI、MAAII(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，FITC 标记的SNA(1∶500)37 ℃孵育1 h，DyLight 594 标记的链霉亲和素(1∶500)37 ℃孵育1 h，通过荧光显微镜观察不同波长处的荧光。

1.10 不同受体结合特性病毒的Dynasore 试验将0.5 MOI 的rDK35/HA-Q226L/G228S 和rDK35/HAA160T 采用最佳Dynasore 工作浓度重复1.4 中实验步骤，16 h 后进行NP 蛋白的IFA 鉴定。

1.11 去除唾液酸细胞的病毒感染试验 将传代悬浮细胞，加入神经氨酸酶37 ℃作用1 h 后鉴定α-2,3、α-2,6 受体的存在。确定作用时间后进行以最佳工作浓度重复1.4 中实验步骤，16 h 进行NP 蛋白的IFA鉴定，观察其荧光强度。

2 结果

2.1 Dynasore 工作浓度的确定 根据特异性荧光强度，确定80 μM 为Dynasore 的最佳工作浓度。浓度小于80 μM 的Dynasore 不能完全抑制病毒感染，而80 μM 的Dynasore 几乎能完全抑制病毒感染，即通过网格蛋白和小窝蛋白介导的病毒侵入作用几乎完全被80 μM Dynasore 抑制。共聚焦显微镜下显示，在Dynasore 存在的情况下，病毒聚集在细胞膜上，并不能进入细胞内(图1A)，而空白对照组中，AIV 能够直接进入细胞核进行下一步复制(图1B)。

图1 Dynasore 作用下的病毒感染Fig.1 The infection of AIV in cells with 80 μM Dynasore

2.2 FBS 诱导的病毒侵入方式 将DK/35 接种于含有80 μM 的Dynasore 的含10 % FBS 培养液中的A549 单层细胞，同时设无血清对照组，以抗AIV NP 蛋白的PcAb 为一抗，FITC-IgG 为二抗，通 过IFA 鉴定流感病毒的复制情况。结果表明，在FBS存在的情况下，Dynasore 不能够完全抑制病毒的感染，而在含有Dynasore 的无血清培养液中的病毒感染能力是完全被抑制的，病毒不能感染细胞(图2)。同样，F-12K 培养液、Dynasore 溶液、10 %血清的F-12K 培养液及10 %血清的80 μM 的Dynasore 溶液上清经TCID50滴定结果中，最高的为F-12K 纯培养液，略高于10 % FBS 组，其次为Dynasore 的FBS组，最低的为Dynasore 组。细胞经流式细胞仪测定同型对照的荧光百分比为1.0 %，结果显示，加入血清后，流感病毒感染细胞的比例相较Dynasore 有了大幅度的提高。因此，在FBS 存在的情况下，可能存在不依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的侵入方式(表1)。

图2 FBS 诱导病毒侵入方式Fig.2 Induced methods of virus cell entry

表1 流式细胞术测定结果Table 1 Detection of the virus infected cells by flow cytometry

2.3 EIPA 对巨胞饮在侵入过程中作用的鉴定 将DK/35 接种于含有75 μM EIPA 的80 μM 的Dynasore 10 % FBS 培养液中的A549 单层细胞，16 h 后进行IFA 鉴定。结果表明，FBS 能够使病毒在Dynasore 存在的情况下进入细胞并进行复制，加入EIPA 后，病毒不能侵入细胞进行复制，即在FBS的诱导下不依赖于网格蛋白和小窝蛋白的病毒侵入方式为巨胞饮(图3)。

2.4 巨胞饮作用在病毒侵入DF1 和MDCK 中的作用 将4 种溶液分别作用于DF1、A549、MDCK 单层细胞后，以0.5 MOI 的DK35 感染细胞16 h 后，采用IFA 判定病毒的扩增。结果表明，在无血清的Dynasore 培养液的条件下，病毒侵入3 种细胞均被抑制，在10 % FBS 存在的情况下，同等浓度Dynasore 的抑制作用均存在不同程度的削弱(图4)，病毒可以侵入细胞进行复制。即在A549、DF1、MDCK中，纯培养液的80 μM Dynasore 中，网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径均被抑制，而FBS 均可以诱导流感病毒通过巨胞饮方式进入细胞。

图3 EIPA 确认巨胞饮作用在侵入过程中发挥作用Fig.3 Identification of the macropinocytosis for virus infection by inhibitor EIPA

图4 巨胞饮作用在病毒侵入不同来源细胞的作用Fig.4 AIV infected different origins of cells via macropinocytosis under the fetal bovine serum condition

2.5 巨胞饮作用在不同受体结合特性的病毒侵入中的作用 将DK/35(禽源和人源受体双重亲和性)、rDK35/HA-Q226L/G228S(人源受体亲和性)和rDK35/HA-A160T(禽源受体亲和性)感染细胞进行试验，利用针对抗NP 的IFA 判断其荧光强度。结果表明，这3 种不同受体亲和性的病毒在FBS 存在情况下，均可以通过巨胞饮作用进入细胞(图5)。

图5 不同受体结合特性病毒均可通过巨胞饮作用感染细胞Fig.5 Viruses of different receptor affinity infected cells through macropinocytosis

2.6 A549 表面的唾液酸受体分布及唾液酸受体缺失对巨胞饮作用作用的影响 使用MAA 对α-2,3 进行标记，通过Dylight594 标记，结果显示α-2,3 呈现红色荧光(图6A)；使用SNA 对α-2,6 受体进行标记，FITC 标记，结果显示α-2,6 呈现绿色荧光(图6B)。通过染色结果判定A549 表面同时存在α-2,3、α-2,6 受体。处理去除唾液酸受体后，再次进行Dynasore 试验，根据针对NP 的IFA 检测可以得出结论，去除唾液酸受体后，即使在FBS 存在的情况下，Dynasore 溶液中3 种不同受体亲和性的病毒也不能侵入细胞(图6C、D、E)。

图6 唾液酸受体缺失对巨胞饮作用的影响Fig.6 Identification of the virus infection in the removed receptors A549 cells

3 讨论

巨胞饮作用与网格蛋白或小窝蛋白介导的侵入方式不同，巨胞饮体的大小不一，没有网格蛋白或小窝蛋白包被，巨胞饮作用目前被认为具有清除凋亡细胞、参与免疫反应、介导部分病原菌侵袭细胞、更新细胞膜等功能[5]。然而，本研究通过对侵入方式的研究，探索出H5N1 亚型流感病毒侵入细胞的其他方式，通过验证得知巨胞饮作用在其中发挥作用。而近年来，H5N1 亚型AIV 对人类的健康造成了严重的威胁，本实验为深入了解流感病毒的感染机理提供了实验思路。

利用巨胞饮作用不依赖于Dynamin 蛋白的特性，采用Dynasore 抑制依赖于Dynamin 蛋白的网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径。在不含FBS 的情况下，Dynasore 能够抑制病毒侵入。在10 % FBS 的作用下，FBS 诱导出非Dynamin 依赖性的侵入方式，采用EIPA 验证后，证明巨胞饮作用在新的侵入方式发挥作用。通过巨胞饮作用进入细胞在不同种源的细胞和不同亲和性的病毒中均存在，可以继续推断细胞种源及唾液酸受体亲和性对于巨胞饮的侵入在很大程度上没有影响。然而将细胞表面的唾液酸受体去除后，巨胞饮的侵入方式也随即失效，病毒不能侵入细胞，表明通过巨胞饮作用侵入的病毒也是依赖于细胞表面的唾液酸受体的。最新研究表明，病毒的形态对于巨胞饮作用的存在可能也会起作用[10]。

流感病毒采取多种方式进入细胞，大量复制后感染机体。因此，对于流感病毒侵入细胞进行清楚彻底的研究和认知，有助于我们对流感病毒致病机理的进一步探究，以及对于流感病毒的防控提供新的思路和想法。

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