浙江新昌光唇鱼(Acrossocheilus)COⅡ和D-loop基因克隆及系统发育分析*

潘 娜 苗 亮 李明云① 郭晓飞 赵 亮 陈 炯 张玉明 吕益龙

(1. 宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室 宁波 315211; 2. 浙江新昌水利水电局 新昌 312500)

在鱼类分类和鉴定中, 传统的形态分类方法有一定的局限性。随着分子生物学技术方法的发展, 基于核苷酸序列分析的分子系统学已成为生物分类和系统发育研究中的一种重要方法。在各种分子标记中,线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)具有分子结构简单、几乎不发生重组、呈母系遗传、进化速度快等特点, 已经成为分子系统学研究中应用最为广泛和有效的分子检测标记之一(肖武汉等, 2000; 赵凯,2006)。同时由于mtDNA的特点, 利用其检测地理隔离在鱼类群体间产生的遗传差异, 已成为近年来鱼类分子遗传学研究的热点之一(Danzman et al, 1991;杨金权等, 2003; Liu et al, 2010)。尽管传统的形态标记、同工酶分析等已成功应用于鱼类种群的识别, 但对于多数鱼类来说, 仍难以揭示出一些重要的遗传变异, 而 mtDNA的丰富变异可作为类群识别的基础(郭新红等, 2004)。为了获得比较准确的物种系统发生关系, 近年来研究者一般采用多个分子标记相结合的方法构建比较客观的系统进化树(陈四海等,2011)。本研究扩增了浙江新昌光唇鱼的线粒体COⅡ和 D-loop序列并进行分子系统发育和进化树分析,结合形态特征观察, 探讨新昌光唇鱼的分类地位, 研究结果可为光唇属鱼类的分类提供理论依据, 并为今后新昌光唇鱼资源的开发和利用提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

2013年 6月从浙江省新昌县山涧溪流中采捕野生光唇鱼样本共14尾, 每尾个体均用HT157型动物标签(广州洪腾条码技术有限公司)进行活体标记后剪取少量尾鳍, 液氮速冻后–80°C保存用于提取DNA。

1.2 方法

对新昌光唇鱼进行外部形态的观察; 然后对其进行常规的测量, 包括头长、体高、吻长、眼后头长、眼间距、眼径、背鳍式、臀鳍式、侧线鳞、鳃耙。测量数据用SPSS软件进行分析。

以常规酚-氯仿法从鳍条中提取DNA (Sambrook et al, 1989)。根据温州光唇鱼(A. wenchowensis)线粒体全序列(GenBank登录号: NC_020145)设计COⅡ扩增引物; 使用黄志坚等(2010)设计的鱼类D-loop扩增引物, 引物序列见表1。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR扩增体系为: 2×Taq Premix-Dye 10μL (上海博彩生物科技有限公司), DNA 模板 2μL (50—100ng/μL), 正、反向引物各 1μL, 加 ddH2O 至 20μL。扩增程序为: 94°C变性 5min; 94°C变性 40s, 退火1min(退火温度见表 1), 72°C延伸 1min, 循环 30次;72°C延伸 10min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

表1 COⅡ和D-loop序列扩增引物Tab.1 The amplification primers of COⅡand D-loop sequences

用胶回收试剂盒(上海博彩生物科技有限公司)回收PCR产物, 与pMD-19载体(TaKaRa)连接后转化入大肠杆菌感受态细胞, 蓝白斑筛选后挑取阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

用 Clustal X软件对获取的浙江新昌光唇鱼 COⅡ、D-loop序列与GenBank中获取的其它鲤科鱼类COⅡ和 D-loop序列(表 2)进行多重比对; 用 MEGA 4.0软件(Tamura et al, 2007)进行各碱基含量和变异情况分析, 用Kimura 2-parameter模型计算序列遗传距离, 并以鲈鱼(Lateolabrax japonicus, 登录号为NC_018045)为外群, 构建邻接法(NJ)分子系统树。

2 结果

2.1 外部形态特征

采集的浙江新昌野生光唇鱼见图 1。经观察, 鱼体长而侧扁, 腹部比较平直或稍呈弧形, 背部上半部分为灰黑色, 下半部分有的带点黄色, 腹面为白色;鼻孔前略成凹陷, 头长[(2.5±0.2)cm]小于体高[(2.6±0.3)cm]。吻钝圆, 向前突出, 吻长[(0.9±0.1)cm]小于眼后头长[(1.1±0.1)cm]; 口下位, 口裂呈浅马蹄形,上唇稍薄, 紧贴于上颌外表, 下唇分两侧瓣, 较臃肿,中央相互接触; 须两对, 口角须略长于眼径, 吻须稍短; 眼间隆起, 间距[(1.3±0.1)cm]远大于眼径[(0.5±0.1)cm]。光唇鱼的背鳍式为DⅡ-9, 背鳍末跟不分枝,背鳍膜间有黑色斑纹; 臀鳍式为A-6; 侧线鳞为39—42(6/A4—5), 侧线上有副孔; 鳃耙数为14—15。有的体侧有6条垂直条纹, 第二条垂直条纹起点位于背鳍起点下方, 向下延伸至腹部; 有的则隐约在尾鳍附近有1—2条垂直条纹; 而有的则没有垂直条纹。

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图1 采自浙江省新昌县溪流的光唇鱼Fig.1 Acrossocheilusi fish sampled from the rivers and creaks in Xinchang, Zhejiang

2.2 新昌光唇鱼COⅡ和D-loop序列特征

经测序, COⅡ引物在浙江新昌光唇鱼中的扩增产物长度为 775bp, 其中 COⅡ基因序列全长均为691bp; 14尾新昌光唇鱼的 COⅡ序列相似度为99.94%, 只存在 6个位点的碱基转换, 其中 T/C和A/G转换位点各3个。新昌光唇鱼COⅡ序列中碱基A、T、G、C的平均组成分别为 31.20%、26.40%、15.30%和27.10%, A+T含量(57.60%)高于G+C含量(42.40%); COⅡ序列的碱基组成均有明显的偏向性,G的含量明显低于其它三种碱基。

D-loop引物在新昌光唇鱼中的扩增产物长度为1112—1118bp, 其中 D-loop基因序列全长为 933—939bp; 新昌光唇鱼群体 D-loop序列的相似度为99.38%, 有22个转换(A-G、T-C)位点、3个颠换(A-C、A-T)位点和 8个插入或者缺失(A、T)位点; 其中碱基A、T、G、C的平均组成分别为34.50%、31.20%、12.80%和21.50%, A+T含量(65.70%)大于G+C含量(34.30%);D-loop序列中也是G的含量明显低于其它三种碱基。

浙江新昌光唇鱼的COⅡ基因均编码230个氨基酸, 都含有一个起始密码子 ATG和不完全的终止密码子T。其 COⅡ和D-loop遗传距离见表3, 其中新昌光唇鱼群体内COⅡ、D-loop基因的平均遗传距离分别为0.003、0.005; 与表2中其它鲤科鱼类的遗传距离分析结果显示, 浙江新昌光唇鱼与温州光唇鱼(A. wenchowensis)的遗传距离最近, COⅡ、D-loop序列遗传距离分别为0.000、0.011。

2.3 基于COⅡ和D-loop序列的系统发育分析

图2为基于COⅡ序列的新昌光唇鱼及其它鲤科鱼类的邻接法(NJ)分子系统发育关系树, 结果显示:光唇鱼属和白甲鱼属的 12种鱼聚为一个大簇; 其中温州光唇鱼与新昌光唇鱼形成一个紧密的簇, 二者亲缘性非常近, 序列比对显示其 COⅡ序列同源性达到 99.94%。之后再与半刺光唇鱼、多彩鲃、台湾铲颌鱼、白甲鱼、粗须白甲鱼、小口白甲鱼和多鳞白甲鱼聚为一簇; 而宽口光唇鱼、稀有白甲鱼和高身白甲鱼三者则单独聚为一簇。另外, 鲤科的各亚科形成 2个大簇, 其中鲃亚科、鲤亚科与野鲮亚科聚为一个大簇, 而鮈亚科、雅罗鱼亚科、鳅鮀亚科、鲴亚科与鲌亚科聚为另一个大簇。另外, 鲤科的鰟鰟亚科与外类群鲈鱼形成一簇。

图2 基于鲤科鱼类线粒体DNA COⅡ序列构建的NJ系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree on COⅡsequences of Cyprinidae fishes constructed by Neighbore-Joining method Bootstrap=1000, 支持率＜50%的未显示, ZJxinchang表示浙江新昌光唇鱼

图3为基于D-loop序列的新昌及其它鲤科鱼类的邻接法(NJ)分子系统发育关系树, 结果显示: 新昌光唇鱼与温州光唇鱼形成一个紧密的簇, 序列比对显示其D-loop序列同源性达到99.36%; 光唇鱼属和白甲鱼属分别相聚后再聚为一簇, 但稀有白甲鱼和高身白甲鱼聚在光唇鱼属的簇中; 鲤科的各亚科形成2个大簇, 其中鲃亚科、鲤亚科与野鲮亚科聚为一簇, 而亚科、雅罗鱼亚科、鳅亚科、鳑鲏亚科、鲴亚科与鲌亚科聚为另一簇。

3 讨论

目前对光唇鱼类的种类划分仍存在一定分歧,如伍献文(1977)鉴定了 19个种和亚种, 并且根据下唇侧瓣的位置不同, 将其划分为光唇鱼亚属(Acrossocheilus)和厚唇鱼亚属(Lissochilichthys)两个亚属; Kottelat(2000)则将光唇鱼属划分为有垂直条纹和无垂直条纹的两个类群, 并认为有垂直条纹类群是狭义的光唇鱼属, 无垂直条纹的种类可能属于吻孔鲃属(Poropuntius); 袁乐洋(2005)也认为无垂直条纹类群可能不属于光唇鱼属。另外, 赵俊等(1997)根据沅江的标本描述了光唇鱼属新种吉首光唇鱼(A.jishousesis), 袁乐洋(2005)也认为吉首光唇鱼是一个有效的种, 但单乡红等(2000)的《中国动物志》中却未确立其物种有效性。究其原因, 一方面光唇鱼属鱼类分布在中国长江以及长江以南各个水系, 且有些物种在多个水系中均有分布, 环境因子会造成种内的不同地理群体间产生一些差异, 再加上种内个体变异、雌雄两性差异以及传统形态特征测量中的人为误差, 往往会使物种鉴定工作变得异常困难, 并且容易产生鉴定错误(袁乐洋, 2005)。本研究中的新昌光唇鱼具有光唇鱼属鱼类的基本特征, 如唇肉质, 包于上下颌外表, 下唇分两侧瓣, 须两对, 背鳍末根不分枝等, 从形态特征上来看, 新昌光唇鱼与已明确种的温州光唇鱼(A. wenchowensis)最为相似。但根据袁乐洋(2005)的描述, 温州光唇鱼(A. wenchowensis)的雄鱼艰眶骨前缘有珠星分布, 雌鱼无珠星; 雄鱼垂直条纹仅限于侧线以上, 沿侧线有一条明显的黑色纵纹,雌鱼纵纹隐约可见, 而采集的 14尾新昌光唇鱼都有珠星, 有些没有垂直条纹, 故单凭外部形态特征难以准确对新昌光唇鱼进行判定。

图3 基于线粒体DNA D-loop序列构建的鲤科NJ系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree on D-loop sequences of Cyprinidae fishes constructed by Neighbore-Joining method Bootstrap=1000, 支持率＜50%的未显示, ZJxinchang表示浙江新昌光唇鱼

线粒体DNA是细胞质中具自主复制、转录和翻译能力的闭合环状双链 DNA, 包括一条重链和一条轻链(李殿香, 2000)。mtDNA具有分子结构简单、几乎不发生重组等特点, 已经成为分子系统学研究的重要标记(肖武汉等, 2000)。其中细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)是线粒体 13种编码基因之一, 已有较多使用COⅡ序列对鱼类进行系统进化和分类研究的报导, 如凌去非等(2006)对25种鲤科鱼类的COⅡ系统进化分析显示雅罗鱼亚科可分为北方和东亚两个类群, 北方类群形成一单系群, 而东亚类群则与鲌亚科、鲴亚科、鲢亚科合为一单系群, 并推断鲌亚科、鲴亚科、鲢亚科可能是由原始的雅罗鱼亚科鱼类在东亚派生的类群; D-loop区域是线粒体中唯一的非编码区, 不受选择压力的影响, 进化速度比较快, 遗传变异较大, 适合于近缘种及种内不同群体间的遗传差异分析(Rosel et al, 1995; Gatt et al, 2000; Zrdoya et al,2000; 陈姝君等, 2008), 如Murakami等(2001)分析了日本169个鲫鱼(Carassius auratus)个体的D-loop序列, 证明了传统形态分类学将白鲫(Carassius auratus cuvieri)定位为鲫鱼的一个亚种的论断。这些研究结果都表明基于线粒体COⅡ和D-loop序列的系统发育分析可以成为传统依据形态学和生物学特征进行物种分类的有效补充。

在基于COⅡ和D-loop序列构建的NJ系统树中,新昌光唇鱼均与温州光唇鱼(A. wenchowensis)形成一个紧密的簇, 二者 COⅡ、D-loop序列的相似性分别为99.94%和99.36%、遗传距离分别为0.000和0.011,均小于 Nei(1987)提出的种间遗传距离大于 0.050的标准, 因此断定浙江省新昌县采集的光唇鱼与温州光唇鱼(A. wenchowensis)为同一种, 但新昌光唇鱼和温州光唇鱼(A. wenchowensis)模式种在形态上有一些不同, 可能是由于环境因素造成的不同地理群体间的差异, 如袁乐洋(2005)描述的浙江和福建两地不同地理群体的温州光唇鱼(A. wenchowensis)存在较大差别, 差别主要在福建群体体侧有 5—6条与体轴垂直的黑色条纹, 浙江群体则有6条垂直条纹, 前者第二条垂直条纹起点位于背鳍末根不分支鳍条基部之后,后者第二条垂直条纹起点位于背鳍起点处等, 而本研究中的新昌群体则有些有6条垂直条纹, 第二条垂直条纹起点位于背鳍起点处, 有的则隐约在臀鳍与尾鳍之间有1—2条垂直条纹, 而有些没有垂直条纹。

本研究所作的系统发育分析显示光唇鱼属与白甲鱼属有较近的亲缘关系, 这与 Wang等(2007)的RAG2序列系统发育分析结果一致。但系统树中两个属的有些种类混杂在一起, 究竟是这些种类有共同的进化起源还是样本采集时的物种鉴定问题, 仍有待进一步深入研究。

光唇鱼作为一种新兴的小型淡水经济鱼类, 具有较大的开发利用价值。笔者在形态特征观察的基础上, 通过扩增COⅡ和D-loop序列并进行序列比对和系统树分析, 确定了新昌光唇鱼和温州光唇鱼(A.wenchowensis)为同一种, 且为二个不同的地理群体,这既有助于今后新昌光唇鱼的资源开发利用, 又可为研究光唇鱼类的分类提供参考资料。

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