尼帕病毒N基因的原核表达

作者单位:400038 重庆,第三军医大学流行病学教研室(梁　栋)；成都军区疾病预防控制中心(梁　栋,石清明,张超雄,陈锚锚,邓成玉,范泉水)；军事医学科学院军事兽医研究所(涂长春)



尼帕病毒N基因的原核表达

作者单位:400038 重庆,第三军医大学流行病学教研室(梁栋)；成都军区疾病预防控制中心(梁栋,石清明,张超雄,陈锚锚,邓成玉,范泉水)；军事医学科学院军事兽医研究所(涂长春)

梁栋,涂长春,石清明,张超雄,陈锚锚,邓成玉,范泉水

[摘要]目的利用尼帕病毒(NiV)的N基因进行原核表达,探讨NiV N蛋白作为检测NiV存在的抗原的可能性。方法利用pET-28a(+)作为表达载体,构建pET-NiV N重组质粒,通过IPTG诱导使其表达蛋白,并用Western blot方法进行原核表达NiV N蛋白的检测。结果通过PCR、酶切和连接反应,成功构建N蛋白的pET-NiV N重组质粒,大小为1596 bp；利用IPTG诱导pET-NiV N重组质粒在宿主菌中表达N蛋白,SDS-PAGE结果显示,55 kD有特异蛋白条带,与蛋白预计大小相符,经Bandscan软件扫描分析,重组蛋白量占菌体总蛋白量的12%；Western blot法检测显示,55 kD的条带显色良好,证明是本实验所需要得到的目的蛋白。结论使用原核表达系统成功表达了NiV的N蛋白,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定了基础。

[关键词]尼帕病毒；N基因；原核表达

Prokaryotic expression of Nipah virus N gene

Liang Dong1,2, Tu Changchun3, Shi Qingming2, Zhang Chaoxiong2, Chen Maomao2, Deng Chengyu2, Fan Quanshui21. Research Room of Epidemiology, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China; 2. The Center for Disease Prevention and Control, Chengdu Military Command, Chengdu, Sichuan, 610021, China; 3. Military Veterinary Research Institute of Military Medical Science Academy of the PLA, Changchun, Jilin, 130000, China

[Abstract]ObjectiveTo explore the possibility of Nipah virus (NiV) N protein as an antigen to detect the presence of NiV by using the prokaryotic expression of NiV N gene.MethodspET-28a (+) was used as an expression vector in order to construct the recombinant plasmid of pET-NivN, which was induced by IPTG to express the protein; and then, Western blot method was used to detect the prokaryotic expression of NivN protein.ResultsBy means of PCR, enzyme digestion and ligation reaction, the recombinant plasmid of pET-NivN was constructed successfully, with a size of 1596 bp; IPTG was used to induce the recombinant plasmid of pET-NivN to express N protein in the host bacteria. SDS-PAGE results showed that 55 kD has a specific protein band with the expected protein size; according to the Bandscan software scanning and analysis, the amount of recombinant protein was 12% of the total bacteria protein. Western blot assay showed that the band of 55 kD has a good color, and this proved that it was just the protein to be obtained in the experiment.ConclusionThe prokaryotic expression system can express N protein of NiV successfully, and this lays solid foundation for further antibody preparation, activity evaluation, and research application.

[Key words]Nipah virus; N gene; prokaryotic expression

尼帕病毒(Nipah virus,NiV)是一种新发现的、人兽共患的副粘病毒,可导致人或动物的脑炎或呼吸道炎症,其致死率很高。由于该种病毒的自然宿主为狐蝠科(Pteropid)的食果蝠蝇(fruit bat)[1],活动范围较广,NiV有可能在一定区域内的食果蝙蝠中相互传播,因此,相同种类蝙蝠分布的国家和地区会面临病毒突变、疫病暴发流行的危险。近年来,NiV在周边国家的流行态势对我国造成了潜在威胁[2-8]。我国目前尚未检出NiV,但是我国东南沿海地区和云南地区具有适合NiV流行的生态环境和宿主动物,且已发现NiV的自然宿主,因此,有必要开展针对NiV检测手段的相关研究。NiV属副粘病毒科成员,为不分节段的负链RNA病毒,其总基因组大小为18.2 kb,共有6个转录单位,编码6个蛋白:磷酸化蛋白(P)、核衣壳蛋白(N)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)和糖蛋白(G),其基因组结构顺序为3'-N-P-M-F-G-L-5'[9]。

NiV病毒N基因全长1596 bp,其编码的N蛋白全长为532个氨基酸。N蛋白为NiV结构蛋白中含量最丰富的蛋白,其产生的抗体中和活性较差[10],但是N蛋白的免疫原性较强,能在早期刺激机体产生抗体,且抗体滴度高、持续时间长,因此,可以作为NiV的检测抗原[11]。

本研究通过基因工程的方法,对NiV的N蛋白进行了原核表达,表达的蛋白可用于建立相应抗体检测方法、开展野生动物的抗体监测以及单克隆抗体的制备。且原核表达的蛋白成本低廉,适合后续研发相应的检测试剂盒。

1材料与方法

1.1材料与设备NiV(澳大利亚动物健康实验室)；含有NiV核蛋白基因(N)的质粒pFBHa-NiVN由上海生工合成；表达载体PET-28a(+)购自Novagen；感受态细胞DH5α、BL21(DE3)购自Tiangen公司；T4DNA连接酶购自Promaga公司；ExTaq聚合酶、IPTG、各种核酸内切酶、DL2000购自TaKaRa大连公司；DNA凝胶片段回收试剂盒购自Axygen公司。PCR细胞仪(CD3221)购自珠海欧雷电子科技有限公司。兔抗NiV全病毒血清,HRP标记的羊抗兔IgG和蛋白印迹Western blot检测所需试剂由上海威奥生物有限公司提供。

1.2方法

1.2.1引物设计参照已经发表的NiV株全序列[12],设计了一对引物(上游引物:NiVNFP；下游引物:NiVNRP),用于NiVN基因的PCR克隆,引物序列见表1。

表1　扩增NiVN基因的引物序列及酶切位点

1.2.2目的基因的PCR扩增和产物回收PCR反应采用25 μl反应体系(共10管,以供PCR产物回收),体系的组成为:10×buffer 2.5 μl,dNTP 2 μl,NiVNFP(10 pmol/μl)1 μl,NiVNRP(10 pmol/μl)1 μl,ExTaq DNA聚合酶1 μl,含有目的基因的质粒1 μl,补加ddH2O至25 μl。PCR反应条件:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,35个循环；最后72 ℃ 5 min延伸后结束反应。取5 μl的PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,拍照后用DNA凝胶片段回收试剂盒进行回收。

1.2.3PCR回收产物和表达载体的双酶切及产物回收将PCR回收产物进行双酶切,反应体系如下:PCR回收产物10 μl,两种核酸内切酶各1 μl,缓冲液2.5 μl,最后补加ddH2O至25 μl,37 ℃水浴酶切1 h,65 ℃灭活15 min,置于-20 ℃超低温冰箱冻存。将表达载体pET-28a(+)进行双酶切,反应体系如下:pET-28a(+)10 μl,两种核酸内切酶各1 μl,缓冲液2.5 μl,最后补加ddH2O至25 μl,37 ℃水浴酶切1 h,65 ℃灭活15 min,电泳观察酶切效果,将切开的载体用DNA凝胶片段回收试剂盒回收。

1.2.4构建重组质粒取酶切好的目的基因片段和表达载体片段,进行连接反应,反应体系如下:目的基因DNA 7.5 μl,表达载体片段0.5 μl,10×T4DNA连接酶1 μl,T4DNA连接酶1 μl,最后补加ddH2O至10 μl,置于16 ℃水浴中过夜连接。

1.2.5诱导目的基因表达取构建好的重组表达质粒PET-NN转化到感受态细胞BL21(DE3)中,将转化子涂平板后接种LB培养基,方法同前。进行菌液PCR和PCR产物双酶切鉴定,并将菌液送检测序。将PCR阳性的菌落接种5 ml Kan+的LB培养基中,培养过夜后,重组菌加入70%的甘油进行保种,剩余的菌种按照0.1%的比例接种于50 ml的Kan+ LB培养基中,37 ℃、160 r/min摇床培养至细菌浓度达到对数生长中期(OD600=0.6~1.0)时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导3 h后,取3 ml菌液离心后,去上清,加入1 ml PBS悬浮细菌,离心,去上清,再加入100 μl的SDS-PAGE上样缓冲液,4 ℃裂解10 min,然后煮沸10 min,离心,取8 μl上清进行SDS-PAGE(浓缩胶浓度5%,分离胶浓度12%)。

1.2.6Western blot蛋白印迹检测首先进行SDS-PAGE电泳,电泳完成后,小心将胶取出置于转膜槽中,转膜条件为15 V,电转20 min后用脱脂牛奶封闭,37 ℃ 2 h。用1∶100稀释的兔抗NiV全病毒血清共孵育2 h,用PBS洗涤3次；二抗为HRP标记的羊抗兔IgG(1∶10 000)孵育30 min,用PBS洗涤3次后,将膜加入底物溶液,显色完毕后拍照记录。

2结果

2.1目的基因的PCR扩增目的基因PCR扩增后,取5 μl进行琼脂糖凝胶电泳,从图1可以看到,PCR扩增产物条带大小约为1596 bp,与预期结果相符。

2.2构建重组质粒PCR扩增的目的基因与pET-28a(+)质粒双酶切后进行连接,连接产物转化BL21(DE3)后,挑取单克隆菌落进行PCR鉴定,得到阳性结果,见图2；提取重组质粒进行双酶切鉴定,双酶切产物的大小和预期相符,见图3。将PCR产物进行测序,结果与NiV N蛋白序列完全一致,命名为pET-NiVN。

2.3重组质粒pET-NiVN的诱导表达pET-NiVN经过IPTG诱导后,进行SDS-PAGE。从图4可以看出,PET-NiVN在55 kD上面有特异性的蛋白条带,与目的蛋白预计大小相符合。

2.4Western blot测定结果为确定本研究中原核表达系统是否成功表达了NiV的N蛋白,将兔抗NiV全病毒血清作为一抗进行定性检验。结果发现55 kD的条带显色良好(图5)。

1:PCR扩增的目的基因产物(图中划圈处)；2:阴性对照；M:DNA Marker DL2000

图2　重组质粒PCR鉴定

M:DNA Marker DL2000；1:阴性对照；2:重组质粒pET-NiVN的PCR扩增产物(图中划圈处)

图3　重组质粒的双酶切鉴定

1:重组质粒pET-NiVN双酶切产物(图中划圈处a:PET-28a(+)载体；b:目的基因)；M:DNA Marker DL2000

图4pET-NiVN经过IPTG诱导后的SDS-PAGE

1:pET-28(a)+转化BL21(DE3)诱导对照；M:蛋白Marker；2:pET-NiVN转化BL21(DE3)诱导后产物(图中划圈处)

图5Western blot测定结果

1:pET-28(a)+转化BL21(DE3)诱导对照；M:蛋白Marker；2:目的蛋白(图中划圈处)

3讨论

NiV是近年来新出现的副粘病毒,能感染多种动物,对人有较高的致死率,因而具有重要的公共卫生学意义。如果直接对NiV的蛋白进行纯化,有一定的危险性,同时纯化成本高、风险大,也为法律所禁止。如果通过基因工程的方法表达N蛋白,不仅生物危险性低,且价格低廉。只要基因工程抗原具有足够高的敏感性,那么利用重组蛋白座位检测用抗原是完全可行的,同时也利于实验的标准化。

本实验将N基因与pET-28a(+)载体的His-Taq基因融合,对重组菌进行诱导表达和SDS-PAGE分析可以清楚看到相对于阴性对照,55 kD处有特异的N蛋白条带,重组蛋白在菌体中主要是以包涵体的形式存在。本研究使用原核表达系统成功表达了NiV的N蛋白,且能在Western blot反应中与阳性血清反应,说明以原核表达的重组N蛋白座位检测抗原是可行的,这为以后建立针对NiV的血清抗体检测的ELISA方法打下了基础。

当然,原核表达出来的N蛋白与NiV的N蛋

白还是存在一定的差异性,这些差异性是否会导致检测方法的假阳性或假阴性,还需要进一步验证。希望在将来的实验中,将表达出来的N蛋白免疫动物,得到抗N蛋白血清,为研制尼帕病毒早期检测试剂奠定研究基础。

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(收稿日期:2014-10-24)

文章编号1004-0188(2015)03-0255-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.009

中图分类号R 373

文献标识码A

通讯作者:范泉水,E-mail:fqs168@126.com