hs-CRP基因及rs1205基因多态性与脑梗死的相关性研究

作者单位:617000 四川 攀枝花,四川省攀枝花市中心医院检验科

罗　茜



hs-CRP基因及rs1205基因多态性与脑梗死的相关性研究

作者单位:617000 四川 攀枝花,四川省攀枝花市中心医院检验科

罗茜

[摘要]目的分析并评价超敏C-反应蛋白(hs-CRP)基因及rs1205基因多态性与脑梗死的相关性。方法将我院神经内科急诊室2012年1月～2013年8月收治的113例中老年脑梗死患者作为观察组,以同期113例健康体检者作为对照组；通过免疫透射比浊法测定血清hs-CRP含量；以聚合酶链式反应(PCR)及限制性片段长度多态(RFLP)方法测定rs1205基因的多态性；采用美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS)量表评定神经功能。结果观察组与对照组的基因型频率与等位基因的分布趋势一致,差异不显著(P>0.05)；重度患者的hs-CRP含量显著高于轻、中度两组(P<0.05)；rs1205基因型与脑梗死病情程度未见相关性(P>0.05)。结论hs-CRP含量与脑梗死患者病情密切相关,rs1205基因多态性与脑梗死发病之间未见相关性。

[关键词]脑梗死；超敏C反应蛋白；基因型；基因频率

Study on correlation between hs-CRP gene and rs1205 gene polymorphism and cerebral infarction

Luo QianDepartment of Laboratory, Central Hospital of Panzhihua City, Panzhihua, Sichuan, 617000, China

[Abstract]ObjectiveTo study the correlation between high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) gene and rs1205 gene polymorphism with cerebral infarction.MethodsThe 113 middle-aged and senile patients with cerebral infarction to receive emergency treatment in Department of Neurology of our hospital from Jan. 2012 to Aug. 2013 constituted an observation group, and 113 healthy people constituted a control group. Immune turbidimetric method was used to determine the contents of hs-CRP, polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) methods were used to determine the rs1205 gene polymorphism, and America National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS) was used to determine the nerve function.ResultsThe distribution trends of the genotype frequency and allele in both groups were uniform, and the difference was not significant (P>0.05); the contents of hs-CRP in patients with severe cerebral infarction were significantly higher than those in patients with mild and moderate cerebral infarction (P<0.05); there was no correlation between rs1205 genotype and severity of the illness (P>0.05).ConclusionThe contents of hs-CRP in patients with cerebral infarction are closely related to the severity of cerebral infarction, and there was no correlation between rs1205 gene polymorphism and cerebral infarction.

[Key words]cerebral infarction; high-sensitivity C-reactive protein; genotype; gene frequency

C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是在机体受损、发生感染或出现炎症时引起血浆浓度急剧上升的重要急性期蛋白[1]。采用免疫增强比浊法大大提高了分析的灵敏度(检测低限为0.005~0.100 mg/L),此类方法所测定的CRP被称为超敏C反应蛋白(hs-CRP)。一直以来,hs-CRP被视为重要的非特异的炎症标志物。但近年来的研究显示,hs-CRP与机体炎症、动脉粥样硬化等心血管疾病过程密切相关[2]。大量文献报道显示,单独测定血清hs-CRP含量能够指示或预测首发与再发脑血管事件[3-5]。目前关于hs-CRP基因及rs1205基因多态性与脑梗死的相关性研究鲜有报道,本研究通过对比老年脑梗死患者与健康体检者的临床资料,旨在评价hs-CRP基因及rs1205基因多态性与脑梗死的相关性。

1对象与方法

1.1研究对象我院神经内科急诊室于2012年1月～2013年8月共收治113例中老年脑梗死患者,将其作为观察组,其中男性79例,女性34例；年龄38~91(64.3±12.1)岁；病程均≤3 d；均符合全国第四届脑血管病学术会议通过的临床诊断标准,同时采用头颅CT/MRI进一步确诊；按照美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)进行病情分级评定:轻度63例(NIHSS分<6),中度39例(NIHSS分6~13),重度11例(NIHSS分≥14)。平均体重指数(BMI)为(24.32±6.38)kg/m2。其中22例有脑卒中家族史,94例有高血压病史,24例有糖尿病史,31例有冠心病史,49例有吸烟史,23例有饮酒史。另选同期我院门诊113例体检者作为对照组,其中男性69例,女44例；年龄47~82(61.9±10.4)岁；平均BMI为(23.92±8.31)kg/m2。其中1例有脑卒中家族史,27例有高血压病史,13例有冠心病史,1例有糖尿病史；17例有吸烟史,10例有饮酒史。两组均排除伴有严重肝肾功能不全者、脑出血、周围血管疾病、血液病、大动脉炎、结核、重症肺部感染、恶性肿瘤以及曾接受器官移植者。两组在年龄、性别、BMI等方面相比无显著差异(P>0.05),具有可比性。

1.2血清hs-CRP含量测定全部受检者清晨空腹(脑梗死患者在发病24 h内,少数患者发病在3 d内)抽取2 ml静脉血,使用荷兰Vital全自动生化分析仪进行分析,通过免疫透射比浊法测定hs-CRP含量,所需检测试剂盒均购自四川迈克科技有限责任公司。

1.3CRP基因型分析(1)抽取5 ml肘静脉血,选择低渗溶血及酚氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA,TE缓冲液溶解保存；通过PCR与限制性片段长度多态性(RFLP)分析rs1205基因多态性,所需酶切及PCR试剂均购自上海生工生物工程有限公司,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成(表1)。(2)25 μl的反应体系包括:10×PCR缓冲液2.5 μl,1 μl 25 mM Mg2+,25 nM 4×dNTP 1 μl,10 μM上、下游引物各1 μl,1 μl基因组DNA模板,0.5 μl Taq DNA聚合酶5 U/μl,2.5 μl二甲基亚砜。扩增程序:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,54 ℃退火50 s,72 ℃延伸55 s,共22个循环,最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存待用。限制性内切酶酶切反应体系总体积20 μl,包括:10 μl PCR扩增产物,2 μl 10×Buffer,2 U内切酶,在37 ℃条件下酶切14 h。将pUC19DNA/MspI酶解片段作为DNA片段的标准物,配置浓度为20%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,结果见图1。

表1hs-CRP基因rs1205 SNP位点、引物序列、内切酶以及酶切片段

引物序列(5'→3')内切酶片段(bp)正向:AACAGGGGCTTTATTGGCTTAATaaICC型:149bp,128bp反向:AATACCCAGGCCACAAGAGTGGCT型:275bp,149bp,128bpTT型:275bp,128bp

图1　rs1205基因酶切片段20%的

2结果

2.1两组基因型对比结果在全部受检者中,rs1205基因型的频率依次为CC 17.3%、CT 48.7%、TT 34.1%；等位基因C频率为0.416,等位基因T频率为0.584,符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.017,P=0.891)。两组受检者的基因型频率与等位基因的分布趋势一致,无统计学差异(P>0.05),见表2。

2.2观察组CRP基因型影响hs-CRP含量情况rs1205的CC、CT、TT三种基因型的Log CRP含量依次为(0.355±0.599)、(0.249±0.601)及(0.168±0.641)mg/L,三者基因型的血清Log CRP含量虽依次递降,但三者差异比较无统计学意义(P>0.05)。

表2　两组rs1205基因型及等位基因频率

2.3不同程度脑梗死患者的hs-CRP含量比较对观察组患者采用NIHSS将其分成3组:轻度组、中度组及重度组。重度患者的hs-CRP与Log CRP含量均显著高于轻、中度两组(P<0.05)；而轻、中度患者的hs-CRP与Log CRP含量相比无显著差异(表3)。

表3　不同程度脑梗死患者的hs-CRP含量比较

注:同轻度及中度组比较,①P<0.05

2.4hs-CRP基因型与NIHSS评分交叉分析将观察组患者rs1205基因型与NIHSS评分制表,采取χ2检验,rs1205基因型与脑梗死程度未见相关(P>0.05,表4)。通过对三类基因型进行测序显示,在CRP1846C>T的扩增产物中,CC基因型中的C突变为TT基因型中的T,与酶切结果完全相符。

表4　hs-CRP基因型与NIHSS评分交叉分析

3讨论

目前已证实动脉粥样硬化是脑梗死的基础病因,而且大量文献资料显示,脑梗死是一个慢性炎性过程[6]。Nozue等[7]的研究显示,性别、年龄及体重等指标能够影响血清CRP含量。CRP能够激活补体,同时增强吞噬细胞的吞噬能力,进而发挥调理功能,有效清除入侵机体的病原菌,修复并清理损伤、坏死及程序化死亡的组织细胞,在天然免疫过程中起保护作用,CRP已被认为是心血管疾病最敏感的保护因子[8]。rs1205基因多态性是CRP最为常见的多态性之一,其位于CRP基因的3′端非翻译区[9]。不同研究机构关于rs1205影响hs-CRP含量的研究结果各不相同[10]。本研究结果显示,带有rs1205T等位基因的受检者血清hs-CRP含量低,但与CRP含量之间无明显的相关性,分析这可能是由于CRP的含量变化由诸多因素决定,而且遗传方面的影响不大[11]。

不同种族、不同地区人群的rs1205的分布各不相同[12]。通过对NCBI中SNP数据库查询显示,欧洲人rs1205T等位基因频率为0.33,非洲人rs1205T等位基因频率为0.15,黄种人(北京地区)则为0.56。在本研究中,rs1205T基因多态性位点共有CC、CT及TT三种基因型,其中等位基因T的频率为0.58。本研究所得等位基因T的分布频率显著高于欧洲人,且与中国北京黄种人的分布频率基本相似[13]。这表明T等位基因频率在不同人种的分布是不同的。

大量文献报道显示,CRP含量与缺血性脑梗死的发病密切相关,而关于CRP基因多态性与缺血性脑梗死的相关性却并无定论[14]。Di Napoli等[15]分析了4个人类CRP 基因多态性基因型:rs1341 662、rs1130864、rs1800947及rs1205后发现,仅rs1800947与缺血性脑梗死有明显的相关性。Tanno等[16]对4个基因多态性位点(rs1205、rs3093075、rs1800947及rs1130864)进行分析,结果显示无相关的SNP位点或SNP单体型与缺血性脑梗死具有关联,但3个SNP位点(rs1130864、rs1800947及rs3093075)与微血管闭室密切相关。Park等[17]的研究亦未见rs1205与缺血性脑梗死具有相关性,但单体型H3与缺血性脑梗死密切相关。本研究未对脑梗死类型进行细致划分及构建单体型,结果显示重度组脑梗死患者的hs-CRP含量明显高于轻度组与中度组,rs1205基因型与脑梗死及脑梗死病情的严重程度均无相关性,与以往报道的结果相符。

总之,本研究结果显示,hs-CRP含量与脑梗死患者病情密切相关,rs1205基因多态性与脑梗死发病之间未见相关性。

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(收稿日期:2014-08-31)

文章编号1004-0188(2015)03-0252-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.008

中图分类号R 743.33

文献标识码A