2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞凋亡相关斑点样蛋白mRNA的表达

谢海龙 李俊立 万 靖 李承彬，*

2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞凋亡相关斑点样蛋白mRNA的表达

谢海龙1李俊立2万 靖2李承彬2，*

目的：分析2型糖尿病(T2DM)合并颈动脉粥样硬化(CAS)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)mRNA的表达及作用。方法：根据华盛顿大学CAS斑块超声分级标准将107例T2DM患者分为单纯T2DM组(n=26)、T2DM轻度斑块组(n=32)、T2DM中度斑块组(n=38)和T2DM重度斑块组(n=11)。另选非T2DM的CAS患者作为单纯CAS组(n=35)，以及体检健康者作为正常对照组(n=35)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)技术检测各组PBMCs中ASC mRNA表达水平。统计分析各组差异及ASC mRNA水平与CAS斑块严重程度的关系。结果：各病例组ASC mRNA表达水平显著高于正常对照组(P<0.05)，T2DM合并CAS组ASC mRNA表达水平显著高于单纯CAS组(P<0.01)；ASC mRNA表达水平轻度斑块组>中度斑块组>重度斑块组，即ASC mRNA表达水平与T2DM患者CAS斑块程度呈明显负相关(r=-0.43，P<0.05)。结论：ASC mRNA表达增加可能是T2DM合并AS的发病因素和CAS斑块活跃性的指征。

2型糖尿病；颈动脉粥样硬化；外周血单个核细胞；凋亡相关斑点样蛋白

炎性小体激活是炎症发生的重要机制，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nod-like Receptor, Pyrin Domain Containing 3,NLRP3)作为胆固醇晶体、胰岛淀粉样多肽等内源性信号受体[1]炎性小体，能启动组织和器官的炎症反应[2],而凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD,ASC)是NLRP3炎性小体的主要组成部分[3]，其mRNA高表达在慢性低度炎性疾病的发生、发展中起一定作用，如2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)、动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)等[4]，但ASC在T2DM合并AS中的表达水平和临床作用少有研究报道。本文检测分析T2DM合并颈动脉粥样硬化(Carotid Atherosclerosis,CAS)患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)中ASC mRNA表达水平与单纯T2DM、单纯CAS患者间的差异，探讨ASC与T2DM合并AS发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 对象与分组

2013-06-2013-12在本院就诊糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)患者中符合中国2型糖尿病防治指南(2013)诊断标准[5]者107例,排除cryopyrin相关周期热综合征、痛风、阿尔茨海默症等炎性疾病。通过双侧颈动脉彩色超声检查并根据美国华盛顿大学CAS斑块的超声分级标准[6]分为单纯T2DM组(n=26，0级，双侧颈动脉均无斑块形成)和T2DM合并CAS组(n=81)，后者又分为三个亚组：即轻度斑块组(n=32，Ⅰ级，单侧颈动脉斑块厚度≤2.0mm)；中度斑块组(n=38，Ⅱ级，单侧颈动脉斑块厚度>2.0mm或双侧均有斑块且其中至少一侧斑块厚度≤2.0mm)；重度斑块组(n=11，Ⅲ级，双侧颈动脉斑块厚度均>2.0 mm)。另选同期非T2DM CAS患者作为单纯CAS组(n=35，患者CAS斑块厚度均为Ⅲ级)。同期体检健康者作为正常对照组(n=35)。各组性别、年龄分布无统计学差异(P>0.05)，各疾病组血糖水平、高血压患者比例等分布差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组一般临床资料比较

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 仪器：多普勒彩色超声诊断仪(IE33，荷兰飞利浦公司)，低温保温箱(DW-40L188，中国青岛海尔集团)，冷冻高速离心机(Auagra，美国贝克曼库尔特公司)，漩涡混匀器(XW-80，中国上海医大仪器厂)，微型离心机(MINI-6K，中国珠海黑马医学仪器有限公司)，原位PCR仪(GENIUS，英国Techne公司)，荧光定量PCR仪(ABI7300，美国ABI公司),自动生化分析仪(DXC800，美国BECKMAN公司)。

1.2.2 试剂：淋巴细胞分离液(批号20130613，北京Solarbio Science公司)，Trizon总RNA提取试剂盒(批号14105， 美国Life Technologies公司)，HIFI-MMLV cDNA第一链合成试剂盒及GoidStar TaqMan Mixture(with ROX)试剂盒(批号00021405和00051310，北京康为世纪生物科技有限公司)，血糖检测试剂盒(批号20130514，四川迈克公司)，β-actin和ASC引物及探针由美国life technologies公司合成。

1.3 检测方法

所有疾病组患者均于初诊时询问、记录年龄、测定血糖、血压，行颈动脉彩色超声检查，并于确诊病情且未予治疗前检测PBMCs中ASC mRNA表达水平；正常对照组于同期检查体检项目(不行颈动脉彩色超声检查)，确认健康者再行检测ASC mRNA。

1.3.1 血压和空腹血糖(Fasting Blood-Glucose，FBG)监测：采用水银血压计按临床常规要求测量受试者右臂收缩压和舒张压，根据《中国高血压防治指南》[7]建议的标准，≥140/90mmHg为高血压。用分离胶采血管采集患者空腹(禁食8h)肘静脉血5ml，静置30min后，3 000r/min 离心10min分离血清，采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法测定FBG。

1.3.2 CAS斑块的超声检测：嘱受试者平卧，采用彩色超声诊断仪，选择10MHz线阵探头扫描双侧颈总动脉、颈总动脉分叉及颈内外动脉内膜中层厚度(Intima Media Thickness,IMT)，测量动脉内斑块厚度，所有病例均选取最大厚度斑块进行比较分析。

1.3.3 ASC mRNA和β-actin检测：方法如下。

(1)引物设计与合成：参照文献[8]，在Gene Bank中搜索人类ASC基因序列和人类β-actin基因序列，使用primer express v2.0设计引物及探针，见表2。

表2 ASC和β-actin引物和探针序列

(2)总RNA提取与逆转录：用EDTA抗凝管采集空腹肘静脉血2ml，混匀后加入2ml生理盐水，再混匀，加2ml淋巴细胞分离液，吸取PBMCs，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用20μl DEPC水溶解备用。通过OD260/OD280鉴定RNA纯度为1.8左右，琼脂糖凝胶电泳鉴定确定为ASC mRNA和β-actin。按cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录反应：配制反应体总体积20μl，包括dNTP Mix 4μl、Primer Mix 2μl、5×RT Buffer 4μl、DTT 2μl、HIFI-MMLV 1μl、RNase-free water 2μl、模板5μl。反应条件：42℃50 min、 85℃5min。产物于-20℃低温冰箱保存备用。

(3)实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-FQ-PCR)：参照GoidStar TaqMan Mixture(with ROX)试剂盒说明书和有关文献[9]，RT-FQ-PCR检测ASC与β-actin时采用分管扩增，反应体积均为20μl，包括2×Glodstar Taqman Mixture 10μl、上下游引物及探针各1μl和逆转录产物5μl，加RNase-Free water 至20μl；反应条件：95℃预变性10min，95℃变性30s，56℃30s，62℃45s，10个循环后95℃变性15s，56℃退火15s，62℃延伸45s，30个循环。每个样本均作三份，取均值采用双德尔塔法计算目的基因的相对表达量，即相对表达量=2-△△Ct，其中△△Ct=(患者目的基因Ct-管家基因Ct)-(正常对照组目的基因Ct-管家基因Ct)。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组ASC mRNA相对表达量

方差分析显示，各组ASC mRNA相对表达量差异有统计学意义(F=14.32，P<0.01)。三病例组均显著高于正常对照组(P<0.05)，T2DM合并CAS组与单纯T2DM组差异无统计学意义(t=1.49,P>0.05)，但高于单纯CAS组(t=4.63,P<0.01)；而单纯T2DM组与单纯CAS组间差异无统计学意义(t=1.19,P>0.05)。见表3。

表3 各组ASC mRNA相对表达量比较

注：与正常对照组比较，1)P<0.05；与单纯CAS组比较,2)P<0.01

2.2 T2DM患者颈动脉斑块厚度与ASC mRNA相对表达量的关系

轻度斑块组ASC mRNA表达量显著高于中度斑块组(t=2.57,P<0.05)和重度斑块组(t=3.32,P<0.01)，中度斑块组与重度斑块组虽差异无统计学意义(t=0.41,P>0.05)，但有减少趋势，即ASC mRNA相对表达量与斑块厚度呈显著负相关(r=-0.43，P<0.05)。见表4和图1。

表4 T2DM合并不同程度颈动脉斑块组ASC mRNA相对表达量比较

注：与T2DM重度斑块组比较，1)P<0.01；与中度斑块组比较，2)P<0.05

图1 T2DM合并CAS患者ASC mRNA表达趋势图

3 讨 论

T2DM和AS是两种常见的代谢性疾病，均表现出持续低水平炎性反应。ASC具有热蛋白结合域和半胱天冬酶募集域(Caspase Recruitment Domain,CARD)两个结构域，可分别结合NLRP3和半胱天冬酶-1(Caspase-1)，形成炎性小体[10]。在T2DM和AS发生时，PBMCs中的单核巨噬细胞受胆固醇晶体、脂肪酸、胰岛淀粉样多肽等物质激活NLRP3，使之募集ASC并与之结合，再激活ASC上的CARD，募集储存状态的Caspase-1形成活化NLRP3炎性小体，参与和传导炎性反应，维持炎症进展，成为T2DM和AS的重要机制[11]。

本研究证实，ASC mRNA在各疾病组中的表达量均显著高于正常对照组(P<0.05)，这与有关文献[3,12,13]的报道相一致。而T2DM合并CAS患者的ASC mRNA表达显著高于单纯CAS组，说明T2DM和CAS的发生、发展与ASC mRNA水平有关，其具体作用可能是机体中PBMCs受到胰岛淀粉样多肽或者胆固醇晶体等的刺激，使细胞内ASC mRNA所在的NLRP3炎性小体活化，促使炎性因子成熟和释放，产生炎症反应，继而在炎症的持续作用下使胰岛β细胞和大动脉病变，导致T2DM和AS的发生发展。

本文对T2DM不同级别颈动脉斑块患者ASC mRNA表达量的分析发现，在斑块形成的不同时期，ASC mRNA表达量不同，其中轻度斑块组表达量显著高于中度和重度斑块组(P<0.05或P<0.01)，即在CAS斑块形成初期的ASC mRNA表达量最高，随着CAS斑块逐渐成熟，ASC mRNA表达渐趋降低。提示ASC mRNA高表达，即炎症早期可能是启动T2DM颈动脉斑块形成的重要因素,而炎症缓解或斑块成熟又可使ASC mRNA表达下调。但其中的具体机制尚不明确，有待进一步研究。

总之,ASC mRNA高表达与T2DM合并CAS有关，PBMCs中ASC mRNA检测或可作为监测T2DM合并AS以及动脉斑块活跃性监测的参考指标。

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本文第一作者简介：

谢海龙(1982-)，男，汉族，硕士研究生，研究方向：心血管疾病的实验室诊断

1 Stienstra R, Tack CJ, Kanneganti TD,et al. The inflammasome puts obesity in the danger zone[J]. Cell Metab ,2012,15(1): 10-18.

2 Wen H, Ting JP, O'Neill LA. A role for the NLRP3 inflammasome in metabolic diseases-did Warburg miss inflammation[J]. Nat Immunol, 2012, 13(4):352-357.

3 Lee HM, Kim JJ, Kim HJ, et al. Upregulated NLRP3 inflammasome activation in patients with type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2013, 62(1):194-204.

4 Wang C, Pan Y, QY Z, et al.Quercetin and allopurinol ameliorate kidney injury in STZ-treated rats with regulation of renal NLRP3 inflammasome activation and lipid accumulation[J]. PLoS One, 2012, 7(6):e38285.

5 中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中华糖尿病杂志,2014,30(10):5-8.

6 朱世明，关玉庆，王 磊.高血压患者颈动脉超声与脑循环动力学的关系[J].中国超声医学杂志，2002，18(8)：21-23.

7 中国高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南2010[J].中华心血管病杂志,2011,39(7):579-616.

8 Luo B, Wang F, Li B, et al. Association of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor 3 inflammasome and adverse clinical outcomes in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy[J]. Clin Chem Lab Med, 2013, 51(7):1 521-1 528.

9 Masters SL, Latz E, O'Neill LA. The inflammasome in atherosclerosis and type 2 diabetes[J]. Sci Transl Med, 2011, 3(1):81-98.

10 Schroder K, Tschopp J. The inflammasomes[J]. Cell, 2010,140(6):821-832.

11 De Nardo D, Latz E. NLRP3 inflammasomes link inflammation and metabolic disease[J]. Trends Immunol, 2011, 32(8):373-379.

12 Boini KM, Xia M, Abais JM, et al. Activation of inflammasomes in podocyte injury of mice on the high fat diet: Effects of ASC gene deletion and silencing[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1843(5):836-845.

13 蒲里津,陆 林,杨 克,等.对氧磷酶-3和糖氧化载脂蛋白A-I与糖尿病并发冠心病的关系[J].微循环学杂志,2014,24(4):20-25.

CD144+/CD62E+内皮微泡：一对监测高血压伴高血脂患者内皮功能的新标记

本刊编委，北京协和医学院、中国医学科学院微循环研究所、国家卫计委微循环重点实验室仉红刚教授课题组于2014年在《International Journal of Cardiology》(IF=6.175)以“CD144+EMPs/CD62E+EMPs: A couple of new biomarkers to monitor endothelial function in hypertension with hyperlipidemia involved” 为题报道了对临床高血压伴高血脂患者进行的内皮细胞来源微泡研究结果，主要内容如下：

1 研究对象和方法

1.1 研究对象：研究对象分为3组：高血压伴高血脂组(n=22)、高血压血脂正常组(n=13)和健康人对照组(n=24)。诊断和评判标准：血压≥140/90mmHg为高血压；总胆固醇≥5.18mmol/L或低密度脂蛋白≥3.37mmol/L或甘油三酯≥1.7mmol/L为高血脂；健康对照者为查体正常、血压<140/90mmHg，且排除高血脂及慢性肾衰、肝病、血液性疾病、炎症、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病史。

1.2 研究方法：以枸橼酸钠抗凝真空管采取3ml外周静脉血液，以1 500g离心10min制备普通血浆，以13 000g离心10min制备去血小板血浆，采用流式细胞术(Accuri C6, Accuri Cytometers)分析CD144+和CD62E+内皮细胞来源的内皮微泡。

1.3 统计学方法：采用SSPS 17.0统计学软件对3组微泡数量差异进行比较，并以年龄、性别等为独立变量建立多元线性回归模型，分析其与CD144+和CD62E+内皮微泡的关系。

2 主要结果

高血压伴高血脂组的CD144+和CD62E+内皮微泡数量显著高于高血压血脂正常组(P=0.033)及健康人对照组(P=0.006)；回归分析未发现CD144+和CD62E+内皮微泡数量与年龄和性别有明显相关性。

3 主要创新结论和意义

本研究在国际上首次报道了CD144+和CD62E+内皮细胞来源微泡是监测高血压伴高血脂的重要内皮损伤相关指标；认为上述指标能够说明伴高血脂的高血压患者其内皮损伤更加严重。CD144+和CD62E+内皮细胞来源微泡为伴高血脂的高血压患者进一步发展为冠心病提供了病理生理过程监测和治疗研究新的切入点。

该研究内容为国家自然科学基金(No.11274046)和北京协和医学院创新基金(No.3332013021)资助项目；英文全文见International Journal of Cardiology,2014,175(1)：203.

Expression of Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD mRNA in Type 2 Diabetes Mellitus and Carotid Atherosclerosis Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

XIE Hai-long1,LI Jun-li2,WAN Jing2,LI Cheng-bin2，*

1Yangtze University, Jingzhou 434020,China;2Department of Laboratory Medicine, Jingzhou City Central Hospital, Jingzhou 434020,China;*

Objective: To analysis expression and role of adaptor protein apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC)mRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of type 2 diabetes mellitus (T2DM) merger with carotid atherosclerosis (CAS) patient. Method: 107 T2DM patients were enrolled, divided them into T2DM group (n=26),T2DM small plaque group (n=32),T2DM moderate plaque group (n=38), T2DM serious plaque group (n=11) according to atherosclerosis plaque ultrasonic classification constituded by Washington university.Another non T2DM CAS patients as CAS group (n=35), and healthy persons as normal control group (n=35).The ASC mRNA expression levels of PBMCs in each group was deteeted by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-FQ-PCR) technology.Statistical analysis of the differences between each group and relationship between ASC mRNA levels and the severity of CAS patches.Results: Expression level of ASC mRNA was significantly higher in the pathological group than normal control group (P<0.05), expression level of ASC mRNA was significantly higher in T2DM combined with CAS group than CAS group (P<0.01),ASC mRNA expression in small plaque group greater than moderate plaque group and severe plaque group,expression of ASC mRNA was negatively correlated with CAS plaque degree in T2DM patients(r=-0.43,P<0.05).Conclusion: Increased expression of ASC mRNA may be risk factor of T2DM combined with AS and CAS.

Type 2 diabetes mellitus;Carotid atherosclerosis；Peripheral blood mononuclear cells；Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD

1长江大学研究生院，湖北荆州 434020；2湖北省荆州市中心医院检验医学部，荆州 434020；*

，E-mail：jzlcb001@163.com

本文2014-11-19收到，2015-01-13修回

R587.1

A

1005-1740(2015)01-0037-05