痰瘀互结型动脉粥样硬化大鼠视网膜和肠系膜微循环观察*

张方申 彭 欣 秦 林 张海燕 闫 滨 武 双

痰瘀互结型动脉粥样硬化大鼠视网膜和肠系膜微循环观察*

张方申1彭 欣2，#秦 林2张海燕2闫 滨2武 双2

目的：观察痰瘀互结型动脉粥样硬化(AS)大鼠视网膜和肠系膜微循环的变化。方法：雄性6周龄Wistar大鼠40只，其中20只采用维生素D3(VD3)大剂量腹腔注射联合高脂乳剂长期灌胃的方法，建立痰瘀互结型AS大鼠模型(AS组)，其余20只平行腹腔注射生理水以及纯净水灌胃作为对照组。对两组大鼠进行视多膜荧光造影，观察视网膜微血管形态及伴行动、静脉管径比值(DA/DV)。采用微循环观测系统分析两组大鼠肠系膜微血管形态、血流速度和DA/DV。结果：VD3大剂量腹腔注射联合高脂乳剂长期灌胃可成功建立痰瘀互结型AS大鼠模型，与对照组比较，AS组大鼠体重增加(t=5.99,P<0.05),总胆固醇水平升高(t=-13.94,P<0.05)，动脉硬化指数(AI)≥4.0。AS组大鼠视网膜及肠系膜微血管数量减少、形态异常，血供不足，血液流速较对照组明显减慢(P<0.05)、微动脉变细、DA/DV明显小于对照组(P均<0.05)；并可见视网膜微血管瘤及血液渗出。结论：观察痰瘀互结型AS大鼠视网膜及肠系膜微循环变化，可为临床诊疗和新药研发提供实验依据。

痰瘀互结；动脉粥样硬化；微循环；大鼠

动脉粥样硬化(AS)患者多表现为体胖多痰、肢体麻木疼痛、苔白腻、脉沉滑或涩、舌暗紫。既有“津液结聚”的痰浊病征，又有“血行缓滞”的血瘀表现。其中医证型为典型的痰瘀互结证[1]。随着国民生活水平的提高，烟酒和肉类饮食的增加，痰瘀互结型AS比例日见增加[2]。

上世纪60年代有临床学者提出，AS患者眼底微循环与心脑血管微循环病变密切相关[3]。晚近临床也发现，AS患者肠系膜磁共振图像也呈现出相应的病理变化[4]。但在基础研究中，AS动物模型的微循环研究尚显不足，痰瘀互结型AS大鼠模型的微循环相关报道更为匮乏。基于AS可能引起全身微循环改变的认识[5],本文对正常大鼠及痰瘀互结型AS大鼠进行了多部位微循环观察比较，为临床诊疗和新药研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

健康雄性6周龄Wistar大鼠40只,体重190±10g，购自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心，许可证号：SCXK(鲁)20130001。按随机数字表法将大鼠分为正常对照组(对照组)和痰瘀互结型AS模型组(AS组)，每组20只。两组大鼠均笼养，普通饲料，洁净饮水。实验室温度21℃-24℃ ，相对湿度55%-75%，光照10h。适应性喂养1周后进行实验。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器：手持式视网膜照相机，日本兴和株式会社生产，型号Genesia-D；共聚焦激光造影系统，德国海德堡公司生产，型号HRA；微循环显微镜和医学图像分析系统，成都泰盟科技有限公司生产，型号BI-2000；电子分析天平，上海精科天平公司生产，型号FA 1004；Image-Pro Plus 5.0.2图像处理分析软件，美国Media Cybernetics出品。水浴温锅、磁力搅拌器、GB303电子天平均由济南长征医疗器械公司提供。

1.2.2 试剂：总胆固醇(TC)测试盒、高密度脂蛋白(HDL)测试盒，北化康泰临床试剂有限公司生产，批号分别为006340和006328；盐酸环喷托酚滴眼液，s.a.ALCON-COUVREURn.v.生产，批号H20070213；荧光素钠注射液，广州白云山明兴制药有限公司生产，批号140201；维生素D3，阿拉丁试剂有限公司生产，批号A1413005；水合氯醛，天津市科密欧化学试剂有限公司生产，批号20130325。高脂乳剂自行配制，所需试剂及方法：猪油20g放入200ml烧杯中，磁力搅拌器加热溶化。当温度升到100℃时加入5g 胆固醇，溶化后再加入1g丙硫氧嘧啶,充分搅匀，然后加入20ml吐温-80制成油相。同时，在另一烧杯中加入蒸馏水30ml和丙二醇20ml，电炉上加热至60℃时加入1g胆酸钠、1g谷氨酸钠,充分搅拌直到完全溶解,制成水相。最后将水相加入油相中充分搅拌混匀，制成高脂乳剂。配制高脂乳剂所需试剂均购自山东永恩试剂耗材有限公司。

1.3 痰瘀互结型AS模型制备[6]和对照组大鼠处理

(1)AS组大鼠按70万IU/kg体重的总剂量腹腔注射VD3，连续三天，1次/天，第一、二天20万IU/kg, 第三天30万IU/kg；对照组大鼠腹腔注射相同体积生理盐水。

(2)VD3注射完成次日，AS组大鼠采用高脂乳剂灌胃(10ml/kg)，1次/天，连续60天，每10天称取一次体重。对照组给予相同体积的纯净水灌胃。

(3)灌胃第60天，所有大鼠禁食12h，断尾取血1ml，枸橼酸钠抗凝，离心后取血浆。酶法测定TC、选择性沉淀法测定HDL，根据公式(TC-HDL)/HDL计算动脉硬化指数(AI)。将AI≥4.0并且爪、唇、舌体暗紫，舌下脉络紫胀，苔腻或黄或白滑，流涎者确定为痰瘀互结型AS成模大鼠[7]。AS组成模16只(4只未成模大鼠从组中剔除)，对照组无成模大鼠。

1.4 微循环观察

1.4.1 视网膜微循环观测：末次灌胃0.5h后，为方便手持视网膜照相机起见，一律选择大鼠右眼观察。腹腔注射5%水合氯醛(3ml/kg)。3min后将盐酸环喷托酚滴眼液1滴滴入大鼠右眼中。2min后用手持式视网膜照相机于暗室中观察大鼠视网膜微循环并拍摄照片，相机曝光强度设定为0.8-0.9，亮度设定为低档。每只大鼠于拍照后10min腹腔注射 10%荧光素钠注射液(0.8ml/kg)，同时用共聚焦

激光造影系统对大鼠视网膜血管进行造影并拍摄照片。对照片中视网膜血管形态进行分析，并通过Image-Pro Plus 5.0.2图像处理软件测量由视盘辐射出的伴行动、静脉管径比值(DA/DV)。

1.4.2 肠系膜微循环观测：大鼠眼底微循环观测后禁食12h。之后腹腔注射5%水合氯醛(5ml/kg)后，于右下腹侧壁开约2cm切口,沿盲肠端轻缓牵出一段小肠袢,将肠系膜平铺于37℃的恒温观察槽上。采用微循环显微镜(×16)和BI-2000医学图象分析系统观察并摄录近盲肠端的左结肠动脉到中结肠动脉之间的肠系膜微血管和血管网微循环血流状态[8]。15min内完成检测。观察指标包括：(1)肠系膜微血管形态：观察微血管数量、血液充盈情况和出血点以及血液流态(线流、线粒流、粒流、摆流)。(2)微血流速度测定：取直径10μm左右的前细动脉及与之伴行的静脉，通过BI-2000医学图像分析系统测定微动脉流速(BFVA)和微静脉流速(BFVV)，每只大鼠选取两对微动、静脉,测量3次取均值。(3)微血管管径测量: 采用BI-2000医学图像分析系统对上述微动脉、微静脉管径(DA、DV)进行测定,每对微动、静脉测量3次取平均值,并计算DA/DV[9，10]。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 成模大鼠特征

(1)AS组20只大鼠中有16只饮食量、活动量减少；毛色无光，双目无神，眼睑变窄甚至出现闭目现象；爪、唇、舌体颜色暗紫，部分舌体出现紫斑，舌下脉络紫胀，舌苔厚腻，并有间歇性大便溏薄，喷嚏、流涎。末次体重(545.18±20.74g)高于对照组(491.00±21.14g)，差异有统计学意义(t=5.99，P<0.05)，符合痰瘀互结证的体态特征。

(2)16只成模大鼠血浆TC含量明显升高，AI≥4.0，均与对照组有明显差异(t=-13.94、-6.54，P均<0.05)，符合痰瘀互结证血脂指标的成模标准，见表1。

2.2 两组大鼠视网膜微循环

2.2.1 微循环形态：结果显示，对照组大鼠眼底呈均匀鲜红色，血供充足，毛细血管丰富；视盘位于眼球后部中央，沿视盘成辐条状发出6-8支细且直的动脉，并伴行6-8支略粗的静脉；动、静脉血管均无明显迂曲，且粗细均匀(图1A)。注射造影剂后眼底血管显影迅速，动、静脉均在10s内完全充盈，无荧光渗漏(图1B)。

表1 两组大鼠TC、HDL、AI 比较

注:与对照组比较,1)P<0.05

AS组大鼠眼底颜色呈淡红色或粉红色，血供明显不足，毛细血管明显减少；视盘周围发出的动、静脉形态不规则、迂曲变形严重，粗细不均匀，并有部分辐射状动、静脉难以辨认或消失(图1C)。眼底血管注射造影剂后显影缓慢(3只大鼠1min时尚未完全显影)，部分可见血管瘤或荧光渗漏(图1D)。

2.2.2 DA/DV：与对照组相比，AS组微动脉变细，微静脉血管较平直。统计结果显示，AS组DA/DV较对照组明显减小，差异有统计学意义(t=4.85，P<0.05)。见表2。

表2 两组大鼠视网膜

注:与对照组比较,1)P<0.05

2.3 两组大鼠肠系膜微循环

2.3.1 微血管形态：对照组大鼠肠系膜微血管数量正常，充盈良好，未见出血点；血管壁平滑完整，粗细均匀；血色深红；管袢血流以线粒流为主，部分为粒流，未见摆流(图2A)。AS组大鼠肠系膜微血管数量明显减少，较多微血管充盈不良，甚至管袢消失；血管壁平滑度较差或管壁增厚；可见陈旧性出血斑；血色暗红；管袢血流以粒线流为主，且有较多摆流或聚集流(图2B)。

2.3.2 微血流速度：AS组大鼠微血流速度明显减慢，BFVA和BFVV均低于对照组，差异有统计学意义(t=6.45、6.76，P均<0.05)，见表3。

2.3.3 微血管管径：与对照相比，AS组DA明显缩窄而DV变化不明显，致DA/DV减小，差异有统计学意义(t=2.42,、2.54，P均<0.05)，见表4。

表3 各组大鼠肠系膜微血管

注:与对照组比较,1)P<0.05

表4 各组大鼠肠系膜微血管DA、DV及

注:与对照组比较,1)P<0.05

[本文图1、图2见封3]

3 讨 论

AS的中医证型按发病频次依次为痰瘀互结型、肝肾阴虚型、气虚血瘀型、脾虚湿盛型，其中痰瘀互结型占32.63%[11]。研究认为该证型由过食肥甘厚腻而致脾虚而生痰、痰阻血脉而生瘀，使津液结聚、血行缓滞，痰瘀互结侵及脉道引起。本实验采用高脂乳剂长期灌胃大鼠，致其痰湿血瘀；通过注射VD3促进血管钙化，协同损伤血管内皮[12]，成功建立痰瘀互结型AS模型。

广义微循环是指直接参与组织、细胞的物质、信息、能量传递的血液、淋巴液、组织液的流动[13]；但狭义微循环专指微动脉、微静脉与组织之间微血管中的血液循环，其重点在微血管的分布、结构、功能及其中血液的流态、流速和理化性质[14]。本文选择观察痰瘀互结型AS大鼠狭义微循环的相关变化。

视网膜微血管分布与脑微血管分布相似，其微循环变化可在一定程度上反映脑微循环，成为在体微循环检查的重要窗口之一[15]。临床研究多在眼部病患或与之相关病变时进行视网膜微循环检查。既往已经开展了的视网膜微循环相关研究的动物实验多为离体观察，如黄晓燕等[16,17]利用消化铺片法分别对高血压大鼠、糖尿病大鼠视网膜进行了相关分析。其局限性在于只是观察视网膜微血管的变化，而无法观察其中的血液循环情况。最近马栋[18]采用眼底血管荧光造影的方法观察了糖尿病动物视网膜微血管损伤，更能说明眼底微循环病理变化。本实验采用视网膜血管造影联合视网膜摄录技术对痰瘀互结型AS视网膜微循环进行了研究。

临床上针对肠系膜的相关检查一般采用CT、磁共振、超声等设备[4,19,20]。在动物实验中，由于设备原因，且可接受有创检查，故多将肠系膜置于倒置显微镜下直接观察其微循环[9,10]。本实验亦是利用该种方法对痰瘀互结型AS肠系膜微循环进行了研究。

本实验研究发现，痰瘀互结型AS同时存在着视网膜及肠系膜微循环的病理变化，包括血液流速减慢、微血管数量减少、微动脉变细和血液渗出。该病理变化过程大致如下：大剂量VD3腹腔注射加上长期高脂灌胃导致大鼠微血管钙化、脂代谢异常，引起血脂升高；高血脂导致动脉粥样硬化加速，并使血浆黏度增高和血小板聚集，从而使血流阻力增大、血液流速减慢、微血管充盈度下降和痉挛；微血管持续性痉挛可引起微动脉内膜深层的脂肪变性和微血管缺血缺氧，导致微动脉管径狭窄或闭塞、血管内皮损伤；血管内皮损伤使微血管通透性增加，导致血液渗出。

痰瘀互结型AS大鼠外周微血管存在微循环障碍，并增加出血风险。微循环观察的动物实验可为临床诊疗和新药研发提供依据。

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本文第一作者简介：

张方申(1989-)，男，汉族，硕士研究生，主要从事生物医学工程技术与现代中医方药研究

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Microcirculation of the Retina and Mesenteric in Atherosclerosis Rats with Syndrome of Intermin-gled Phlegm and Blood Stasis

ZHANG Fang-shen1,PENG Xin2, #,QIN Lin2,ZHANG Hai-yan2,YAN Bin2,WU Shuang2

1Institute of Technology, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250300,China;2Institute of Basic Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;#

Objective: To observe the retina and mesenteric microcirculation change of atherosclerosis (AS) rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis.Method: There were 40 male Wistar rats,20 of which used the method of VD3 large-dose intraperitoneal injection combined with long-term high-fat emulsion gavage , establishing the model of AS rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis. The rest 20 of them as control group made parallel intraperitoneal injection with physiological water and pure water gavage.Contrasted success model group (AS group,n=16)with control group and analysed retina and mesenteric microcirculation.Compared these two groups in retinal vascular morphology, arteriovenous diameter DO value(DA/DV),mesenteric microvessels,blood flow velocity, and the difference between DA and DV.Results: Intraperitoneal injection of large doses VD3 combined with fat emulsion long-term gavage method successfully builded the model of AS rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis. Compared with control group,AS rats gained weight(t=5.99,P<0.05),total cholesterol levels elevated(t=-13.94,P<0.05),atherosclerosis index(AI) was≥4.0 and retina and mesenteric microcirculation insufficiency appeared, the blood flow velocity slowed down,the number of microvessels reduced,DA/DV significantly reduced (P<0.05) and arterioles became thinner and had blood oozing. Conclusion:The retina and mesenteric microcirculation change of the AS model rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis can provide experimental foundation for clinical diagnosis and drug discovery.

Syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis;Atherosclerosis;Microcirculation;Rats

山东省自然科学基金资助项目(ZR2013HM053)；山东省教育厅科技计划基金资助项目(J06L19)

1山东中医药大学理工学院，济南，250300；2山东中医药大学基础医学院，济南，250355；#

，E-mail: qinlin0531@163.com

本文2014-11-25收到，2015-01-04修回

R331.3+5 R255.9

A

1005-1740(2015)01-0010-05