细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶1预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用*

王卫星 师贞宗 陈先祥

细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶1预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用*

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目的：探讨细胞穿透肽PEP-1介导的血红素加氧酶-1(HO-1)对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)的保护作用。方法：(1)用基因工程学方法人工合成融合蛋白PEP-1-HO-1。(2)选择雄性SD大鼠,随机分为三组(n均=8)：假手术组(S组)只开腹，不予干预。HIRI模型组(HIRI组)，采用夹闭肝动脉和门静脉30min后恢复血流；HIRI+PEP-1-HO-1预处理组(HIRI+HO-1组)，夹闭肝动脉和门静脉前经门静脉注射PEP-1-HO-1蛋白1mg，其余处理同HIRI组。(3)实验完成后，取三组大鼠下腔静脉血，采用自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、总胆红素(TBIL)等肝功能指标。处死大鼠,取部分肝脏进行组织切片、HE染色，观察各组肝组织病理学变化。结果：成功制备高纯度PEP-1-HO-1融合蛋白。HIRI组大鼠各项肝功能指标均显著高于S组(P<0.01), HIRI+HO-1组各项肝功能指标值明显低于HIRI组(P<0.01)，但仍高于S组(P<0.05)。HIRI组肝细胞肿大或呈球形，胞浆疏松水样变或完全透明，伴炎细胞浸润，可见片状坏死。HIRI+HO-1组肝脏损伤程度较HIRI组明显改善，炎性细胞浸润及肝细胞坏死程度明显减轻，但与 S组比较，肝脏组织损伤仍明显。结论：用细胞穿透肽PEP-1介导HO-1预处理能有效保护肝细胞，明显减轻肝功能损害。

细胞穿透肽PEP-1；血红素加氧酶1；肝脏缺血再灌注损伤；大鼠

肝脏移植术已成为终末期肝病的最佳治疗手段，但手术过程中的缺血再灌注(IR)造成的肝脏损伤比较突出，成为亟待解决的重要课题。目前已有研究[1]显示血红素加氧酶1(HO-1)可在肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)中起重要作用，能明显减轻HIRI、并能延长移植器官保存时限。本实验采用分子生物学方法，用人HO-1cDNA质粒与细胞穿透酶PEP-1连接形成的活性PEP-1-HO-1融合蛋白预处理HIRI大鼠，结果显示其有明显改善肝功能和减轻肝组织损伤的功效，且目的蛋白剂量易于控制，应用时限易于掌握。结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

台式高速冷冻离心机(Hettich，Universal 32R，德国)，超速冷冻离心机(HITACHI himac CP80MX，日本)，倒置显微镜(Nikon，日本)，水浴恒温摇床(SHY-2，中国江苏)，全自动生化分析仪(HITACHI，日本)；异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG，美国Promega公司)，Ni2+-NTA-树脂(美国Qigen公司)，PEP-1肽DNA序列(KETWWETWWETWSQPKKKRKV)由北京赛百盛基因技术有限公司合成，大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS为湖北医药学院临床研究所赠送，其余试剂为国产分析纯。

1.2 PEP-1-HO-1融合蛋白的制备

按照颜学韬等[2]的方法制备融合蛋白PEP-1-HO-1。将构建的原核表达质粒pET15b-PEP-1-HO-1转化感受态宿主菌大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,用IPTG诱导表达PEP-1-HO-1靶蛋白,采用Ni2+-NTA对其纯化，取纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,将样品蛋白转移到NC膜上,用抗His-tag抗体孵育,采用Western Blotting显示分析。以牛血清白蛋白(BSA,1mg/ml)进行标准对照,采用Bradford法进行蛋白浓度测定，获得稳定表达纯度的PEP-1-HO-1融合蛋白溶液，分装后存放于冰箱(-21℃)保存备用。

1.3 实验动物及分组处理

24只SD雄性大鼠(湖北医药学院实验动物中心购进)，体重220-250g。采用随机数字表法分为三组，每组8只，术前禁食12h，自由饮水。(1)假手术组(S组)：只开腹，不予干预；(2)HIRI模型组(HIRI组)：参照Yamada等[4]的方法，将实验动物乙醚吸入麻醉后开腹，腹腔内滴10%水合氯醛1ml补充麻醉，分离暴露第一肝门见肝动脉、门静脉及胆总管，用无损伤血管夹夹闭肝动脉及门静脉(不夹胆管),30min后恢复血流灌注；(3)HIRI+PEP-1-HO-1预处理(HIRI+HO-1组)：夹闭肝动脉和门静脉前，每只大鼠均经门静脉一次性注入PEP-1-HO-1融合蛋白1mg,其余操作同HIRI组。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 血液学检测：各组大鼠均在实验完成后经下腔静脉取血5ml，加入含肝素抗凝管中，常温下1 500r/min离心5min，取血清4℃保存。由本院生化室主管技师按常规操作测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、总胆红素(TBIL)等肝功能指标水平。

1.4.2 组织病理学检测：下腔静脉取血后断头处死大鼠，立即取肝左叶部分组织置于40g/L多聚甲醛液中固定，石蜡包埋，连续切片(5μm)，常规HE染色，显微镜观察各组肝脏组织病理变化。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 融合蛋白PEP-1-HO-1的检测及纯度

电泳凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。结果显示，在分子量35KD处见一明显条带，即融合蛋白PEP-1-HO-1(图1)。经Bradford法测定PEP-1-HO-1融合蛋白浓度为1.6mg/ml。

图1 SDS-PAGE电泳图

A，纯化前PEP-1-HO-1蛋白(峰值)；B，纯化前PEP-1-HO-1蛋白(均值)；C，纯化后PEP-1-HO-1蛋白

2.2 各组肝功能指标比较

三组肝功能指标间差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较表明，HIRI组和HIRI-HO-1组各项指标测定值均显著高于S组(t值均>3.016，P<0.05或P<0.01)，但HIRI+HO-1组显著低于HIRI组(t值均>5.378，P均<0.05)。见表1。

表1 各组肝功能指标均=8)

注：与S组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与HIRI组比较，3)P<0.05

2.3 各组肝脏组织学变化

大体观察：S组大鼠肝脏表面颜色红润，色泽均匀，富有弹性；HIRI组肝脏缺血30min后，肝脏明显苍白，但仍有弹性；恢复灌注瞬间，缺血肝组织立即呈暗红色，且色泽均匀，再灌注后肝叶表现为表面小叶灌注不良，呈散在小叶状分布。HIRI+HO-1组大鼠肝脏颜色仍较红润，色泽大体均匀，弹性较好，散在少许点状苍白。

显微观察：S组肝脏组织结构清晰，小叶中央静脉、肝细胞索、肝窦、汇管区结构清晰，无明显炎性细胞浸润。HIRI组大鼠恢复灌注后缺血肝叶组织呈现肝细胞肿大，胞浆疏松呈网状、半透明呈水样变性或肝细胞胀大呈球形，胞浆几乎完全透明，呈气球样变，伴大量嗜酸性小体形成及嗜酸性坏死或灶状或片状坏死，且伴明显炎性细胞浸润。HIRI+HO-1组较HIRI明显改善，但仍见肝细胞部分气球样变、肝索紊乱；少量嗜酸性小体形成及嗜酸性坏死或点状坏死或片状坏死，且伴少量炎性细胞浸润。见图2。

[本文图2见封3]

3 讨 论

HIRI是影响肝脏外科手术，尤其肝移植存活率和远期疗效的重要因素之一。因其不仅可以引起超急性排斥期移植器官功能障碍，而且可以增加急性和慢性排斥反应的发生[5]。氧自由基、中性粒细胞及内皮细胞的激活在HIRI中起着十分重要的作用[6，7]。如何应对HIRI成为目前研究的热点，HO-1作为保护性蛋白也愈来愈受到关注。

临床研究[8]显示，HO-1在肝、肺、肾等血管比较丰富的脏器组织IRI中表达显著增强，对IRI有明显保护作用。动物实验发现HO-1的表达上调在许多动物移植模型中具有减轻移植物IRI和排斥反应的作用，表现为多形核中性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞浸润明显减轻，促炎因子如白细胞介素1(IL-1)、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)水平显著下降，而且HO-1高表达还可以抑制内皮细胞凋亡，增加局部血液灌注量，改善微循环障碍[9]，从而明显延长移植器官的存活时间。进一步研究[10]表明，应用细胞穿透肽PEP-1转导HO-1进入人肝细胞株LO2，对缺氧复氧模型的肝细胞有良好保护作用，并且其效果与融合蛋白PEP-1-HO-1有一定的浓度及时间依赖关系。通过不同方法建立HIRI模型后，用腺相关病毒介导HO-1进入动物体内，对HIRI也有改善作用[11]。本实验成功复制HIRI模型，并采用细胞穿透肽PEP-1作为分子载体，将有活性的融合蛋白PEP-1-HO-1成功转导进入肝细胞，有效地改善了HIRI后肝功能和肝组织损害。与上述研究结果相一致。

天然有活性的HO-1在生物体内没有特异性通道或介质进入细胞内，需要一种介质导入细胞才能发挥作用。既往研究中，有人利用腺病毒作为载体转染HO-1基因的方法进行大鼠HIRI的干预研究，获得一定效果，但该方法存在基因导入率低，导入可控性差，安全性不确定等不足之处[11]，从而限制了该方法的应用。本文选择安全、高效、无毒的PEP-1[12]作为转导介质，运用生物工程学方法将人HO-1的cDNA与介质质粒pET-15PEP-1-HO-1链接，然后转入宿主菌大肠杆菌Rosetta内，成功高效表达具有天然活性PEP-1-HO-1蛋白，并在上述动物实验中显示出良好的抗HIRI作用。其机制可能是HO-1能控制细胞内自由铁水平，降解胆色素，释放一氧化碳(CO)，进而表现出抗氧化、维持肝细胞微循环稳定，抗凋亡、抑制增殖，抗炎与免疫调节等作用[13]。

总之，HIRI是一个复杂的过程，涉及多个细胞类型和多种氧化应激反应。通过对肝脏进行预处理，或通过使用新的抗氧化剂防止氧化应激反应，或许是很有前景的治疗策略。HO-1及其它的应用研究对这一策略的实现有重要意义。今后尚需加强HO-1的作用机制，尤其是分子机制的深入研究，为临床应用提供可靠的理论依据。

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本文第一作者简介：

王卫星(1960—)，男，汉族，医学博士，主任医师、教授、博士生导师。 主要从事肝胆胰腺外科、微创外科及临床静脉营养的研究，并致力于胰腺癌和胰腺炎的基础研究

1KerrJF，WyllieAM，CurrieAR.Apoptosis:basicbiologicalphenomenonwithwide-rangingimplicationsintissuekinetics[J].BRJCancer，2012，26(4)：239-257.

2 颜学滔,王焱林,王家宁,等.血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1的制备及在大鼠H9c2心肌细胞的转导[J].武汉大学学报(医学版),2010，31(4):21-25.

3YinDP,SankaryH,ChongA,etal．Protectiveeffectofischcmicpreconditioningonliverpreservation-reperfusioninjuryinrats[J].Transplantation, 2010，66(2):152-157.

4YamadaF,SaitoT,AbeT,etal．Ischemicpreconditioningenhancesregenerativecapacityofhepatocytesinlong-termiscbemicallydamagedratlivers[J].GastroenterolHepatol，2011,22(11):1 971-1 977．

5SinhaS,BastinME,WhitleIR,etal.DifusiontensorMRimagingofhighgradecerebralgliomas[J].AJNR,2002,23(4):520-527．

6 吕 平,陈道达,田 源,等.肝缺血再灌注损伤预处理保护作用与一氧化氮/内皮素-1系统有关[J].中国病理生理杂志,2000,6(10):901-905．

7 王万铁,林丽娜,谢克俭,等.异丙酚对兔肝缺血再灌注损伤中一氧化氮和内皮素的干预[J]．中国急救医学,2004,24(1):4-6．

8MasiniE,VannacciA,MarzoeeaC,etal．Hemeoxygenase-1andtheischemia-reperfusioninjuryintheratheart[J]．ExpBiolMcd(Mavwood)，2013,22(8):546-549．

9KatoriM,AnselmoDM,BusunnilRW,etal.Anovelstrategyagainstischemiaandreperfusioninjury：cytopmtoctionwithhcmeoxygenasesystem[J]．TransplantImmunol，2012，9(24)：227-233．

10 陶绍富,王春锋,丁 晶，等.上调肝脏HO-1抑制肥大细胞脱颗粒减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤[J].中华普通外科杂志,2011,26(9):766-769.

11 王 云,沈 健,许永华，等.血红素加氧酶1诱导自噬减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤[J].中华消化外科杂志,2013,12(7):538-543.

12MadaniF，LindbergS，LangerlU，etal.Machenismofcellularuptakecell-penetratingpeptides[J].Biophys，2011，20(11):414-729.

13KatofiM，BusutilRW，Kupiec-WeglinskiJW．Hemeoxygenase-1systeminorgantransplantation[J]．Transplantation，2012，74(7)：905-912．

Cell Penetrating Peptides PEP-1 Mediated Heme Oxygenase 1 Pretreatment on the Protection of Hepar Ischemia-reperfusion Injury in Rats

WANG Wei-xing1,SHI Zhen-zong1,CHEN Xian-xiang2,#

1Department of General Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;2Department of General Surgery,Renmin Hospital of Shiyan City Affiliated Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;#

Objective: To study liver protection of PEP-1 mediated heme oxygenase 1(HO-1) in rat hepar ischemia-reperfusion injury(HIRI). Method: (1)Synthetic protein (PEP-1-HO-1) was made by genetic engineering methods. (2)24 male SD rats were randomly assigned to three groups:the sham group(S group), HIRI model group(HIRI group), HIRI and PEP-1-HO-1 pretreatment group(HIRI+HO-1 group).(3) After experiment completely，extraction of three groups of inferior vena venous blood of rats by automatic biochemical analyzer determine serum：cereal third transominase (ALT), aspertate aminotransferase (AST), gamma glutamyl transpeptidase(γ-GT), total bilirubin (TBIL) and liver function indicators.Taking part executed in rats after the liver biopsy HE staining,each group liver tissue pathological changes were observed. Results: Successful preparation of high purity PEP-1-HO-1 fusion protein. Rats liver function index HIRI group were significantly higher than S group (P<0.01),HIRI+ HO-1 set of various liver function index was lower than that in group HIRI (P<0.01),but it was still higher than the group S (P<0.05).HIRI+HO-1 set of HIRI group significantly reduced degree of liver injury, inflammatory cell infiltration and necrosis of liver cells was significantly reduced，but compared with the group S ，the liver tissue damage was still obvious.Conclusion: It can pretreatment effectively protect the liver cells with cell penetrating peptides PEP-1 mediated heme oxygenase 1，significantly reduce liver damage.

PEP-1;HO-1；Hepar ischemia-reperfusion injury；Rat

湖北省教育厅科学技术研究计划重点项目(编号D20082045)

1武汉大学人民医院普外科，武汉 430060；2湖北医药学院附属十堰市人民医院普外科，十堰 442000；#

，E-mail：chenxian881@hotmail.com

本文2014-11-08收到，2014-12-28修回

R575

A

1005-1740(2015)01-0014-04