高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠胰岛IRc/IRS-1低表达*

谢 敏 李 竞 高 凌 徐晓艺 李 铮

高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠胰岛IRc/IRS-1低表达*

谢 敏 李 竞#高 凌 徐晓艺 李 铮

目的：观察高脂饮食诱导的胰岛素抵抗模型小鼠胰岛上胰岛素受体(IRc)/胰岛素受体底物-1(IRS-1)表达的变化。方法：20只雄性昆明小鼠随机分为高脂饲料模型组和普通饲料对照组，每组各10只。喂养20周后，观察两组小鼠大体情况，称量体重(BW)，酶法测空腹血糖(FBG)，酶联免疫法测空腹胰岛素(FIns)浓度，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)；HE染色观察胰岛组织学变化；免疫组织化学染色分析胰岛IRc/IRS-1的表达。比较两组各检测指标的统计学差异。结果：模型组FBG、HOMA-IR明显高于对照组(P均<0.01)；胰岛边界欠完整，内部结构紊乱，伴炎性细胞浸润；IRc/IRS-1的表达较对照组明显降低(P均<0.05)。结论：高脂饮食可成功诱导小鼠外周胰岛素抵抗，且胰岛上IRc/IRS-1的表达降低。

高脂饮食；胰岛素抵抗；胰岛素受体；胰岛素受体底物-1

胰岛素抵抗是2型糖尿病主要病理生理机制之一，同时对代谢综合征的形成也起关键作用。胰岛素抵抗的机制十分复杂，通常根据胰岛素的作用环节，分别在胰岛素受体前、受体及受体后三个水平上进行探讨，近年研究认为胰岛素抵抗主要是因受体后信号传导障碍所致[1]。既往有研究[2-4]发现，在动物和人的α细胞和β细胞上存在胰岛素受体及其下游的信号通路，即胰岛素受体(Insulin Receptor，IRc)/胰岛素受体底物-1(Insulin Receptor Substrate-1,IRS-1)，但对其在胰岛中的信号传导研究较少。本研究采用高脂饮食喂养小鼠诱导胰岛素抵抗模型，观察其胰岛IRc/IRS-1表达水平的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：昆明小鼠，SPF级，雄性，3-4周龄，体重28-32g，购自武汉大学实验动物中心，质量合格证号：SCXK(鄂)2008-0004。饲养于武汉大学人民医院动物实验室，SPF级环境。实验动物适应性饲养一周后，按随机数字表法分为两组，每组10只：对照组采用普通饲料喂养，脂肪占总热量的10%；模型组所喂饲料中脂肪占总热量的60%。两组小鼠均分笼饲养，自由进食进水，光照时间为每日8∶00 至20∶00，共饲养20 周。

1.1.2 主要试剂与仪器：胰岛素放射免疫测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，E-EL-M0054)，IRc抗体(美国abcam公司，ab60946)，IRS-1抗体(美国abcam公司，ab52167)，戊巴比妥钠、4%中性甲醛、无水乙醇、二甲苯、PBS缓冲液、EDTA抗原修复液(武汉谷歌生物科技公司)，BSA(美国Sigma公司)。

血糖仪与血糖试纸(稳豪，美国强生)，分析天平(CP124S，德国Sartorius)，称量器(MP2001，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，病理切片机(RM2016，上海徕卡仪器有限公司)，酶标仪(Victor3 1420 Multilable Counter，美国Perkin Elmer)，倒置荧光显微镜(IX51，日本奥林巴斯)。

1.2 检测指标和方法

1.2.1 小鼠大体情况及体重：喂养20周后，观察小鼠毛色及精神状况，观测垫料潮湿程度(评估尿量)，并称量两组小鼠体重。

1.2.2 空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIns)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)：两组小鼠喂养20周后禁食12h，用3%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，将尾尖剪去5mm，自尾根部向尾尖端按摩至血液流出；取血液按血糖仪操作说明测定FBG。之后，用左手拇、食指抓住小鼠双耳及颈后皮肤，小指固定尾部，中指将小鼠左侧前肢轻压在胸骨心脏部位，无名指按在腹部,使左侧眼球突出；以弯头镊摘去眼球，将头向下倒置，血液自眼眶流出，留取血液静置30min后，4℃，10 000rpm离心20min，吸取上层血清，用放射免疫分析法检测FIns，具体操作按试剂盒说明书进行。HOMA-IR=(FBG×FIns)/22.5，其中FBG单位为mmol/L，FIns单位为mU/L，HOMA-IR>2.7为胰岛素抵抗模型制作成功[5]。

1.2.3 胰腺HE染色：眼框取血后断椎处死小鼠，开腹，在脾、胃之间和十二指肠弯处分离并取出胰腺，放入4%中性甲醛(用pH 7.0-7.2的磷酸缓冲液配制)中固定48h后酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，连续切片(约4μm)，常规HE染色，光镜下观察胰岛形态和组织学变化。

1.2.4 IRc/IRS-1测定：将上述石蜡包埋胰腺组织切片，进行脱蜡、脱水，3%过氧化氢避光室温静置30min后冲洗，进行抗原修复；将稀释一抗(1∶100)滴于切片上，室温过夜孵育；冲洗，自然干燥后加入二抗，室温孵育30min，用PBS反复冲洗3次；滴加碱性磷酸酶标记的链酶卵白素工作液，室温孵育；冲洗，滴加显色剂，显微镜下观察并及时用自来水冲洗以终止反应；最后用自来水冲洗，复染、脱水、透明、封片。IRc/IRS-1阳性表达区域为黄色。采用OLYMPUS IX51显微镜进行图像采集，IPP6.0图像分析系统检测图片中阳性染色区域的平均光密度值(MOD)。每只小鼠取3张切片，每张切片选取3-6个胰岛进行观察，取其平均值为该只小鼠IRc/IRS-1的表达水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组小鼠体重和一般情况比较

造模前，两组小鼠皮毛光泽度好，精神良好。造模后，模型组小鼠毛发暗黄，精神烦躁，摄食增加，饮水增多，尿量增多；体重较对照组有所增加，但差异无统计学意义(63.75±6.30g vs 58.88±7.59g，t=-1.617，P>0.05)。

2.2 两组小鼠FBG、FIns和HOMA-IR比较

20周后，模型组小鼠FBG和HOMA-IR明显高于对照组(t=-5.142， -4.674，P均<0.01)，两组FIns水平差异无统计学意义(t=-1.927，P>0.05)。见表1。

2.3 两组小鼠胰岛形态比较

对照组小鼠胰岛大小不等，分布均匀，界限清晰，未见炎性细胞和水肿。模型组小鼠胰岛边界欠完整，内部结构紊乱，胰腺组织血管内有炎性细胞浸润(见图1)。

2.4 两组小鼠胰岛IRc、IRS-1表达比较

IRc、IRS-l仅在胰岛细胞中表达。模型组小鼠IRc 、IRS-1在胰岛的中心及周边均有减少(图2)，半定量分析显示,模型组小鼠IRc 、IRS-1的表达明显低于对照组(t= 3.534，4.025，P<0.05或P<0.01，见表2)。

表1 两组小鼠FBG、FIns和HOMA-IR比较均=10)

注：与对照组比较，1)P<0.01

表2 两组胰岛细胞IRc、IRS-1表达量比较均=10)

注：与对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

[本文图1、图2见封2]

3 讨 论

胰岛素抵抗作为2型糖尿病、高血压、脂代谢紊乱、微量蛋白尿、多囊卵巢综合征、高凝血症等代谢综合征共同的发病基础而备受重视[6]，但胰岛素抵抗的发生机制十分复杂，从胰岛素合成、与细胞表面的胰岛素受体结合、到胰岛素最终生理效应的实现等一系列过程都与其相关。目前的研究认为2型糖尿病的受体前水平缺陷不是胰岛素抵抗的主要原因，胰岛素受体和受体后缺陷才是重要原因[1,7]。

早在1985年，Van Schravendijk等[8]就采用放射性配基法确定了分离纯化的α细胞和β细胞上均存在IRc。随后Harbeck等[9]发现，胰岛β细胞上存在胰岛素信号转导通路，且认为β细胞的IRS-1与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)介导的胰岛素分泌有关，IRS-2与β细胞自身的生长、生存和功能有关[10]。而Araujo等[4]通过荧光双标染色观察到胰岛α细胞与β细胞一样，也表达IRC、IRS-1和IRS-2蛋白，并证实胰岛素能通过IRS-1途径抑制胰岛α细胞胰高血糖素的表达和释放。

在本实验中高脂饲料喂养20周小鼠的FBG和HOMA-IR明显高于对照组，同时，胰岛IRc、IRS-1表达阳性，且模型组小鼠胰岛中心及周边区域IRc 、IRS-1的表达较对照组小鼠明显降低，表明α细胞和β细胞都出现了IRc 和IRS-1表达下调。

综上，高脂饲料喂养20周可致小鼠外周胰岛素抵抗，验证了高脂饮食与肥胖、胰岛素抵抗的关系。胰岛IRc 和IRS-1表达下调与胰岛α细胞和β细胞的胰岛素信号转导障碍有关。提示可通过上调胰岛IRc/IRS-1通路来减少胰岛素抵抗的发生，为代谢性疾病治疗提供新的方向。

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本文第一作者简介：

谢 敏(1989—),女,汉族,硕士研究生,研究方向:2型糖尿病及其并发症

1 Copps KD, White MF. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2[J]. Diabetologia,2012,55(10):2 565-2 582.

2 Piro S, Maniscalchi ET, Monello A, et al. Palmitate affects insulin receptor phosphorylation and intracellular insulin signal in a pancreatic alpha-cell line[J]. Endocrinology,2010,151(9):4 197-4 206.

3 Leibiger IB, Leibiger B, Berggren PO. Insulin feedback action on pancreatic beta-cell function[J]. FEBS Lett,2002,532(1-2):1-6.

4 Araujo EP, Amaral ME, Souza CT, et al. Blockade of IRS1 in isolated rat pancreatic islets improves glucose-induced insulin secretion[J]. FEBS Lett,2002,531(3):437-442.

5 Geloneze B, Vasques AC, Stabe CF, et al. HOMA1-IR and HOMA2-IR indexes in identifying insulin resistance and metabolic syndrome: Brazilian metabolic syndrome study (BRAMS)[J]. Arq Bras Endocrinol Metabol,2009,53(2):281-287.

6 李 竞，毛拓华. 糖尿病微血管病变[J]. 微循环学杂志,2013,23(2):1-4.

7 Erol A. Insulin resistance is an evolutionarily conserved physiological mechanism at the cellular level for protection against increased oxidative stress[J]. Bioessays,2007,29(8):811-818.

8 Van Schravendijk CF, Foriers A, Hooghe-Peters EL, et al. Pancreatic hormone receptors on islet cells[J]. Endocrinology,1985,117(3):841-848.

9 Harbeck MC, Louie DC, Howland J, et al. Expression of insulin receptor mRNA and insulin receptor substrate 1 in pancreatic islet beta-cells[J]. Diabetes,1996,45(6):711-717.

10 Togashi Y, Shirakawa J, Orime K, et al. beta-Cell proliferation after a partial pancreatectomy is independent of IRS-2 in mice[J]. Endocrinology,2014,155(5):1643-1652.

Low Expression of Islet IRc/IRS-1 in High-fat Diet induced Insulin Resistance Mice

XIE Min,LI Jing#,GAO Ling,XU Xiao-yi,LI Zheng

Department of Endocrinology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China；#

Objective: To observe high-fat diet induced insulin resistance mice model and the expression of islet insulin receptor( IRc)/insulin receptor substrate-1(IRS-1).Method: 20 male KM mice were randomly divided into two groups,which were fed with normal diet (control group) and high-fat diet (model group) respectively.Feeding 20 weeks later,the weight,fasting blood glucose, serum insulin levels and HOMA-IR were detected and the pancreatic tissue was observed through tissue slice with HE. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of IRc and IRS-1.Results: The fasting blood glucose and HOMA-IR were significantly higher in model group than control group(P<0.01).Islet area was significantly less in model group than control group(P<0.05),and islet boundary was incomplete, internal structure of islet disorder, with inflammatory cells infiltration.The expression of the IRc and IRS-1 significant decreased in model group(P<0.05).Conclusion: High-fat diet can induce insulin resistance of mice and decrease the expression of islet IRc/IRS-1.

High-fat diet;Insulin resistance;Insulin receptor;Insulin receptor substrate-1

国家自然科学基金资助项目(81170767)

武汉大学人民医院内分泌科，武汉 430030；#

，E-mail: lijing7823@hotmail.com

本文2014-09-12收到，2014-12-02修回

R587.1

A

1005-1740(2015)01-0001-03