SD大鼠视网膜微动脉平滑肌细胞分离和消化方法*

邵 珺 孙 尉 姚 勇，# 王如心

SD大鼠视网膜微动脉平滑肌细胞分离和消化方法*

邵 珺1孙 尉2姚 勇1，#王如心3

目的：探讨分离、消化SD大鼠视网膜微动脉平滑肌细胞(RMASMCs)的方法。方法：取正常SD大鼠眼球，分离视网膜微动脉，利用不同消化酶消化不同时间后，分离RMASMCs，在倒置显微镜下观察RMASMCs形态，并行免疫组化法鉴定。结果：解剖显微镜下成功急性分离视网膜动脉分支,即视网膜微动脉(直径40.23±5.61μm)。1、2、3号消化酶各消化10-16min，RMASMCs数量逐步增多，16min时最多(13.4±1.3个/低倍视野)，与其它消化时间相比，差异有统计学意义(P<0.05)。倒置显微镜下观察收获的RMASMCs呈长梭形、细胞膜完整、边缘光滑；免疫组化染色鉴定其胞浆呈α-action阳性表达。结论：采用急性分离、逐步消化的方法能成功获取较多数量和较高质量的RMASMCs。

视网膜动脉平滑肌细胞；分离消化；大鼠

动物视网膜微动脉平滑肌细胞(Retinal Microartery Smooth Muscle Cells, RMASMCs) 的获取是其电生理及细胞内钙活动等研究所必需，对如何获得数量较多、质量较好的RMASMCs，国外现有报道的几种方法及结果各不相同[1,2]，国内尚未见相关研究报道。本实验采用急性分离SD大鼠视网膜动脉，对其分支(微动脉)采用不同消化酶消化不同时间后计数细胞数量，并进行免疫组化鉴定，为分离出数量较多、质量较稳定的RMASMCs提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：8-12周龄，体重200±30g SD大鼠(江苏省血吸虫病防治研究所动物中心提供)30只，雌雄不拘。于室温18-25℃，相对湿度50%-80%条件下饲养。明暗周期12h，自由摄食、饮水。

1.1.2 实验器材：SHZ-82水浴恒温振荡器(金坛市医疗仪器厂)；SANXIN PHB-3/pH计(上海三信仪表厂)；BT25S电子天平(Sartorius，北京科学仪器厂)；Simplicity 纯水系统(Millipore,美国)；SZX10解剖显微镜、LG-PS2光源、眼科手术器械及IX71倒置显微镜均为日本Olympus公司产品。

1.1.3 实验试剂：二硫苏糖醇(43819 BioChemika Fluka，美国)，II型胶原酶(4176 Worthington,美国)，牛血清白蛋白(A3803)、木瓜蛋白酶(P4762)、胰蛋白酶抑制剂(T9128)、弹性蛋白酶(E0258)、HEPES(H4034)、Glucose(G7528)均购自美国Sigma公司。

(1)视网膜动脉保存液(mmol/L)的制备：NaCl 140.0、KCl 5.0、CaCl22.0、D-glucose 5.0、MgCl21.3、HEPES 10.0，用NaOH调pH至7.3[5]。

(2)视网膜动脉消化液的制备：1号消化液：牛血清白蛋白1mg加保存液1ml。2号消化液：木瓜蛋白酶1.5mg、二硫苏糖醇1mg，加1号消化液1ml。3号消化液：II型胶原酶1mg、胰蛋白酶抑制剂1mg、弹性蛋白酶0.25mg,加1号消化液1ml。0号消化液：II型胶原酶1mg加1号消化液1ml。以上消化液配制好后，以1ml为单位分装于Eppendorf管中，-20 °C保存，两周内使用。

1.2 方法

1.2.1 分离视网膜动脉：以1.5%戊巴比妥钠3ml腹腔注射麻醉。颈椎脱臼法处死大鼠，用眼科镊及眼科剪取下眼球，放入保存液中，4℃冰箱保存，48h内将眼球置于琼脂板上固定，在解剖显微镜下(×10)左手持眼科显微无齿镊,右手持Alcon 15°刀,沿睫状体扁平部垂直刺入,划开一个约1/4圈的切口。右手换持角膜剪,沿着划开的口子将角膜剪开,取下角膜，完整取出晶状体，暴露玻璃体。继续在显微镜下(×10)找到视网膜动脉主要分支(直径40.23±5.61μm，即视网膜微动脉，见图1)，用眼科显微无齿镊小心分离，尽量剔除周边黏附的玻璃体及视网膜组织后置于1ml EP管中。

1.2.2 消化视网膜微动脉：打开水浴恒温振荡器(37℃)，将置有视网膜微动脉的EP管放入其中。按照0、1、2、3号消化液(各1ml)先后顺序进行消化，0号消化液消化30min，1、2、3号消化液各消化10-16min(根据预实验每批次的木瓜蛋白酶质量和血管大小进行调整)。消化完成后过滤，离心弃上清，吹散至溶液混浊无组织块，吸取适量悬液在倒置显微镜下观察，每个样本取3-5个低倍镜视野，计数平滑肌细胞。

1.2.3 免疫组化染色： 将上述RMASMCs用适量PBS漂洗，离心弃上清，加少量PBS吹散混匀，吸取适量均匀涂布于经多聚赖氨酸处理的玻片上，室温风扇吹干，用无水丙酮固定10min，采用免疫组化SABC法，观察RMASMC胞浆中的a-actin表达。具体步骤按试剂说明书操作：(1)先滴加鼠源α-actin单克隆抗体(1∶50)，4℃冰箱过夜；滴加二抗37℃孵育；滴加三抗37℃孵育20min；加DAB显色10min，苏木精复染后，脱水、透明、封片,显微镜观察。胞浆中见染成棕色，并与细胞长轴平行的纤维丝为α-actin阳性表达，亦即平滑肌细胞。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 RMASMCs数量和形态

急性分离的视网膜微动脉，经过0号消化液消化30min，再经过1、2、3号消化液各消化10-16min，所获得的细胞数量随消化时间的延长而增加，各消化时间组细胞数量差异有统计学意义(F=5.64，P<0.05)。16min时平滑肌细胞数量明显多于10-14min各组(q均≥5.17,P均<0.05)。显微镜下大多数RMVSMCs呈长梭形，部分呈短杆状，花生状；轮廓清晰，胞浆完整，边缘整齐，符合血管平滑肌细胞形态特征[3]。见图2A。

表1 消化不同时间获得的RMASMCs数量(个/低倍镜视野

注：与其它各时间点相比较，1)P<0．05

2.2 免疫组化鉴定

分离的RMASMCs，经SABC染色后，低倍镜下观察胞浆呈棕黄色，细胞核为淡蓝色，高倍镜下可见胞浆内大量呈棕色、并与细胞长轴平行的纤维细丝，肌丝结构清晰可辨，即为α-actin阳性。 见图2B。

[本文图1、图2见封4]

3 讨 论

通过作者前期对不同分离和消化条件的摸索，本文总结报道能获取数量较多、质量较好的RMASMCs的实验方法，为国内相关研究提供参照。根据作者工作中的经验和体会，进一步提请注意下列影响因素。

3.1 动物个体差异

SD大鼠视网膜血管的个体差异较大，同一批大鼠，体重相近者,其视网膜动脉口径可有明显差异，从血管口径较小的大鼠分离的RMASMCs在数量和质量上较血管口径较大者稍差。因为血管口径不同而长度相同动脉上的平滑肌细胞数量不同，对此只能通过增加实验动物的数量来减少其对实验的影响。

3.2 分离消化方法

本文作者最初采用有关文献中介绍的两种方法分离消化视网膜动脉，一种是分离视网膜色素上皮层全层进行消化[1]，另一种是将其剪成1/4大小进行消化[2]，均未获得成功。后来参考分离冠状动脉的方法[4-7]，在尽可能多的剔除其周边附着的玻璃体，并且增加针对玻璃体成分的消化步骤后，基本获得成功。消化酶应该选择质量更有保证的产品，尤其是最重要的木瓜蛋白酶，每更换一批次的酶，都需要重新调整消化时间，因为木瓜蛋白酶容易受潮，一旦受潮将明显影响其消化效果。 故消化时间经常是最终影响细胞质量的重要因素，消化时间过长会导致细胞膜受损，但消化时间过短，所获细胞数量较少。需要根据血管口径大小及消化酶质量调整消化时间，血管口径越大，消化所需时间越长，酶的质量越好则消化时间越短[8]。通过反复摸索，本文提示0号消化酶消化30min以后，1、2、3号消化酶各消化16min时所获得的细胞数量最多、细胞形态较好，且杂质少。

对分离、消化后的细胞尚需进行鉴定，本文采用免疫组化方法观察所获细胞胞浆中含有大量棕黄色纤维丝，即α-actin，该阳性反应说明本文分离、消化的细胞是平滑肌细胞。

3.3 温度

合适的温度是消化酶工作的重要条件，实验室温度应该控制在20℃左右，并且待室温较为稳定后才能开始消化。水浴箱中温度要控制在37℃。

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本文第一作者简介：

邵 珺(1983-)，女，汉族，主治医师，研究方向：糖尿病视网膜病变基础与临床

1 Scholfield CN，Curtis TM. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina [J]. Microvasc Res,2000, 59 (2):233-242.

2 Ishizaki E, Fukumoto M, Puro DG. Functional KATPchannels in the rat retinal microvasculature: topographical distribution, redox regulation, spermine modulation and diabetic alteration [J]. J Physiol，2009,587(13):2 233-2 253.

3 王如兴，蒋文平.正常耐钙Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离方法及体会[J].中国心脏起搏与心电生理杂志，2007，21(11):159-162.

4 Lu T, Zhang DM, Wang XL, et al. Regulation of coronary arterial BK channels by caveolae-mediated angiotensin II signaling in diabetes mellitus[J]．Circ Res，2010，106(6):1 164-1 173.

5 王如兴,李肖蓉,羊镇宇,等．大电导钙离子激活钾通道对糖尿病大鼠冠状动脉血管张力的调节[J].中华医学杂志,2010,90(36): 2 575-2 578.

6 McGahon MK, Zhang XH, Scholfield CN，et al. Selective downregulation of the BK beta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes[J]. Channels (Austin),2007,1(3):141-143.

7 来利红，王如兴，蒋文平．酶消化法急性分离大鼠主动脉平滑肌细胞及其鉴定[J]．苏州大学学报，2008,28(1):23-25．

8 Cai Q，Zhu ZL, Fan XL，et al．Whole-cell recordings of calcium and potassium currents in acutely isolated smooth muscle cells[J]．World J Gastroenterol，2006,12(25)：4 086-4 088．

Isolation and Digestion Method of Normal Retinal Artery Smooth Muscle Cells of Spraque-Dawley Rat

SHAO Jun1, SUN Wei2, YAO Yong1，#, WANG Ru-xin3

1Department of Ophthalmology；3Depertment of Cardiology, Wuxi People’s Hospital of Nanjing Medical University, Wuxi 214023, China；2Suzhou City Hospital,Suzhou 215000,China;#

Objective: To investigate the isolated and digest approach of retinal microartery smooth muscle cells (RMASMCs) of SD rats.Method: SD rats were sacrificed after taking the eyes, using different digestive enzymes to digest different times,separate retinal microartery. RMASMCs morphology was observed under an inverted microscope and identified by immunohistochemical staining. Results: Acute dissecting microscope successfully separate branch retinal artery that retinal arteriolar diameter was 40.23±5.61μm. No.1,2,3 digestive enzymes to digest each 10 to 16 minutes, RMASMCs gradually increased, to 16 min when the largest number of smooth muscle cells, was 13.40±1.30/low magnification, compared with other digestion time, the difference was statistically significant (P<0.05). Cells were observed under an inverted microscope RMASMCs typical fusiform smooth muscle cell membrane integrity, smooth edges;its showed α-action positive expression by immunohistochemical staining.Conclusion: Acute phase separation and digestion method can successfully obtain larger quantities and higher quality RMASMCs.

Retinal microartery smooth muscle cells;Separation；Rats

国家自然科学基金资助项目(编号81400415)；江苏省自然科学基金资助项目(编号SBK201222073)

南京医科大学附属无锡市人民医院，无锡 214000；1眼科；3心内科；2苏州市立医院，苏州 215000；#

，E-mail：pardl@126.com

本文2014-11-12收到，2014-12-01修回

R77 R322.9+1

A

1005-1740(2015)01-0023-03