糖尿病肾病大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体与肾脏损伤和细胞凋亡的关系*

徐春艳 赵林双,2,#

糖尿病肾病大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体与肾脏损伤和细胞凋亡的关系*

徐春艳1赵林双1,2,#

目的：探讨糖尿病肾病(DN)大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体(AT1-AA)与肾脏组织病理变化和肾小管上皮细胞及肾小球足细胞凋亡的关系。方法：36只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组(NC组，n=6)和DN模型组(DN组，n=30)，DN组大鼠给予高糖高脂喂养联合小剂量(35mg/kg)链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立DN模型。应用ELISA检测各组大鼠血清AT1-AA水平，并据此将各组再分为AT1-AA阳性和阴性亚组，检测各组大鼠血糖(BG)、肾功能指标及肾脏肥大指数(KW/BW)；采用HE染色和透射电镜观察各组大鼠肾小管和肾小球病理变化；采用TUNEL法检测肾小管上皮细胞和肾小球足细胞凋亡。结果：DN组大鼠AT1-AA水平和阳性率明显高于NC组(P<0.05或P<0.01)。与NC组比较，AT1-AA阳性DN大鼠肌酐清除率(Ccr)显著降低，BG、肾功能指标及KW/BW明显升高(均P<0.01)；AT1-AA阴性DN大鼠除BG和KW/BW外，其它指标与AT1-AA阳性DN大鼠差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与NC组比较，AT1-AA阳性DN大鼠均出现肾组织及超微结构病理变化，肾小管上皮细胞和肾小球足细胞凋亡率亦显著升高(P<0.01)；AT1-AA阴性DN大鼠肾脏未见明显病变，细胞凋亡率显著低于AT1-AA阳性DN大鼠(P<0.05)。结论：AT1-AA水平变化与DN大鼠肾小管上皮细胞和肾小球足细胞凋亡有关，可能通过介导细胞凋亡而参与肾脏损害过程。

血管紧张素Ⅱ1型受体；自身抗体；细胞凋亡；糖尿病肾病

随着糖尿病患病率在全球范围内的普遍增加，各种并发症也逐年上升，其中30%-40%的患者有发生糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)的危险。作为糖尿病危险而严重的微血管并发症之一[1]，DN已成为西方国家终末期肾病的首要病因，若不及时诊治，最终会成为血液透析甚至肾脏移植的主要原因[2]。深入了解DN的发病机制，寻找有效防治DN的方法一直是糖尿病和肾脏病领域的研究热点。

自1999年血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体(Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor Autoantibody，AT1-AA)首次在先兆子痫患者体内被发现以来[3]，国内外学者相继在高血压病和移植排斥反应患者体内观察到AT1-AA可与血管紧张素Ⅱ1型受体 (Angiotensin ⅡType 1 Receptor，AT1R) 结合，发挥类似AngⅡ的激动效应[4-6]，并能增强机体对AngⅡ的敏感性[7]。作者前期临床研究[8]已发现，DN患者体内AT1-AA阳性率明显高于糖尿病患者和正常对照者，且与尿蛋白水平正相关。而且肾小管上皮细胞和肾脏足细胞损伤在DN患者蛋白尿的出现和进程中也起着重要作用[9]，但对AT1-AA介导的肾脏细胞损伤和凋亡的研究目前尚未见报道。因此，本研究通过测定DN大鼠血清AT1-AA水平并分析其与肾脏功能和结构改变，以及与肾小管上皮细胞和足细胞凋亡之间的关系，以明确AT1-AA相关的自身免疫机制在DN进程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄雄性SD大鼠购自武汉大学动物实验中心，共36只(合格证号42000500001559)。饲养于室温20-24℃、相对湿度40%-60%环境，自由摄食饮水，12h交替照明。

1.2 试剂与仪器

链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，美国Sigma公司，货号S0130)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(美国Promega公司，货号G7360)；血糖(BG)测试盒(北京拜尔迪生物技术有限公司，货号EBGL-100)，肌酐和尿素氮测试盒(南京建成生物工程研究所，货号分别为C011，C013-2)；尿微量白蛋白(UMA)测定试剂盒(桂林英美特生物技术有限公司，批号U88011020)；AT1R抗原多肽和AT1-AA阳性和阴性大鼠血清(华中科技大学附属协和医院心血管实验室)。血糖仪(OneTouch UltraVue型，美国Johnson公司)；多肽自动合成仪(PSSM-8型，日本Shimadzu公司)；分光光度计(752型，上海舜宇恒科学仪器有限公司)；酶标仪(RT-6500型，美国Bio-Rad公司)；全自动生化仪 (UniCelDxC 800型，美国Beckman Coulter公司)；彩色医学图文分析系统(HMIAS-2000型，武汉千屏影像技术有限责任公司)；透射电镜(HITACHIH-7000FA型，日本TOSHIBA公司)。

1.3 DN大鼠模型复制

36只SD大鼠适应性喂养一周后采用随机数字表法分为正常对照组(NC组，n=6)和DN模型组(DN组，n=30)。NC组大鼠以普通饲料喂养，DN组大鼠以高糖高脂饲料(在普通饲料中加入2.5%胆固醇、0.4%胆酸钠、10%蔗糖、10%猪油)喂养。4周后，禁食10h，DN组大鼠腹腔注射1% STZ溶液(35mg/kg)；NC组注射等量柠檬酸缓冲液。3天后两组大鼠均尾静脉取血检测随机BG， 10天后以同样方法再检测一次，对末次BG>16.7mmol/L大鼠继续高糖高脂喂养12周，使其自然进展为DN[10]。NC组6只大鼠均未成模，DN组大鼠成模24只，未成模型1只，死亡5只。

1.4 标本收集与处理

两组大鼠于成模前1天用代谢笼收集24h尿液，记录尿量。于成模当天两组大鼠称取体重后，10%水合氯醛(0.2ml/100g)腹腔注射麻醉，腔静脉采血，分离血清，-20℃保存。断颈处死两组大鼠，分别摘取双侧肾脏，去除包膜，生理盐水洗净，滤纸吸干水分后用电子天平称重，计算肾脏肥大指数(KW/BW)[双侧肾脏重量(g)/体重(g)×100%]。将左侧肾脏横向切分为两份，一份用4%多聚甲醛固定24h，用作HE染色和TUNEL细胞凋亡检测；另一份用双刀法切取小块肾皮质，2.5%戊二醛固定后常规方法制作电镜标本。

1.5 血清AT1-AA检测

采用ELISA检测血清AT1-AA[11]。将合成的AT1R抗原多肽片段溶于0.1mmol/L的碳酸缓冲液(pH=9.6)中，配成100μg/ml的抗原包被液，每孔100μl的量包被反应，4℃过夜；血清封闭酶标反应孔后加入倍比稀释1∶40的实验大鼠血清100μl，37℃反应40min；加入1∶2 000辣根过氧化物酶酶标抗体，37℃反应30min后加底物显色。实验中设置AT1-AA阳性和阴性对照，阳性对照为AT1-AA阳性的健康大鼠血清，阴性对照为AT1-AA阴性的健康大鼠血清。当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果。光密度(OD)值测定及结果判断：在酶标仪上以450nm波长测定OD值。测OD值时以实验样本与阴性对照的吸光度之比([样本OD值-空白对照OD值]/[阴性对照OD值-空白对照OD值])>2.1即判为AT1-AA阳性[11]。

1.6 BG和肾功能指标检测

大鼠血液标本离心后分离血清，尿液标本离心后取上清液，采用全自动生化仪及配套试剂按说明书测定BG(葡萄糖氧化酶法)、血尿素氮(BUN，脲酶法)、血肌酐(Scr)，尿肌酐(Ucr) (苦味酸法)和24h UMA (免疫比浊法)，并计算肌酐清除率(Ccr)=[Ucr (g/L) / Scr (g/L)]×[24h尿量(ml) / (24h×60min)]。

1.7 肾脏组织学观察

(1)光镜观察：4%多聚甲醛固定的肾脏组织按常规方法梯度脱水、石蜡包埋、切片(5μm)、HE染色，光镜观察组织形态学改变。(2)电镜观察：2.5%戊二醛固定的肾皮质组织小块按常规方法梯度脱水、树脂包埋、超薄切片(50nm)、醋酸铀-柠檬酸铅染色，透射电镜观察肾皮质超微结构变化。

1.8 细胞凋亡检测

采用TUNEL法。将上述石蜡包埋肾组织切片常规脱蜡入水，蛋白酶K室温下消化，TDT酶反应液37℃湿盒中孵育60min，0.3%的过氧化氢抑制内源性过氧化氢酶，链霉亲和素辣根过氧化酶室温孵育30min，DAB显色，苏木素复染。阴性对照采用无TDT酶标记液，其它操作同上。光镜观察凋亡细胞呈棕褐色，每张切片选取10个视野，用医学图文分析系统计数肾小管上皮细胞和肾小球足细胞凋亡数，计算细胞凋亡率。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 DN组大鼠血清AT1-AA水平和阳性率

血清AT1-AA的水平(OD值)，DN组较NC组显著升高(t=13.133，P<0.01)。DN组血清AT1-AA阳性15例，NC组仅1例，两组间阳性率差异有统计学意义(χ2=4.051，P<0.05)，见表1。

表1 两组大鼠血清AT1-AA水平和阳性率

注：与NC组比较，1)P<0.01，2)P<0.05

2.2 各组大鼠BG、肾功能指标及KW/BW比较

与NC组比较，DN组大鼠BG、BUN、24h UMA水平及KW/BW均显著升高(t分别为21.955、6.818、9.747、8.176，均P<0.01)，Ccr明显降低(t=6.233，P<0.01)。进一步比较发现，DN组AT1-AA阳性和AT1-AA阴性大鼠BG、BUN、24h UMA水平及KW/BW均较NC组明显升高，Ccr明显降低(均P<0.01)；而DN组AT1-AA阳性大鼠除BG和KW/BW外，其它上述指标与AT1-AA阴性DN大鼠水平差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠BG、肾功能指标和

注：与NC组比较，1)P<0.01；与AT1-AA阴性DN组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

2.3 各组大鼠肾组织变化特征

大体观，与NC组比较，DN组大鼠肾脏体积增大，质地变硬。光镜下，NC组AT1-AA阴性大鼠肾脏体积和结构均无明显变化，AT1-AA阳性大鼠肾小管上皮细胞内偶见空泡变性；DN组大鼠肾小管上皮细胞空泡变性，部分肾小管内有蛋白管型，肾小球体积增大、系膜细胞增多、系膜增宽；AT1-AA阳性大鼠肾脏组织病变较AT1-AA阴性大鼠严重。见图1。

透射电镜显示，NC组AT1-AA阴性大鼠肾脏超微结构未见明显异常(图2A)。NC组AT1-AA阳性大鼠仅表现为少数肾小管上皮细胞水肿，内质网稍肿胀(图2B)。DN组AT1-AA阴性大鼠肾小管上皮细胞水肿、内质网肿胀或部分溶解、微绒毛排列紊乱；肾小球基底膜局部增厚，可见足突部分融合(图2C)。DN组AT1-AA阳性大鼠肾小管上皮细胞严重水肿、内质网溶解、胞核浓缩、胞膜破裂、微绒毛排列紊乱，管腔中见大量脱落上皮细胞、部分管腔闭塞；肾小球系膜基质增多、基底膜明显增厚、足突融合、间隙增宽，偶见肾小球硬化(图2D)。

2.4 各组大鼠肾小管上皮细胞和肾小球足细胞凋亡率

NC组AT1-AA阳性和阴性大鼠细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(t=0.132，P>0.05)。DN组大鼠肾小管上皮细胞和肾小球足细胞均有凋亡，以肾小管上皮细胞凋亡为主。DN组AT1-AA阳性大鼠凋亡率明显大于AT1-AA阴性大鼠(t=4.127，P<0.01)；DN组总凋亡率明显大于NC组，差异有统计学意义(t=14.504，P<0.01)，见表3。

2.5 AT1-AA与其它指标相关性

Spearman相关分析显示，DN组大鼠AT1-AA水平与BUN、24h UMA水平及KW/BW呈显著正相关(r分别为0.671、0.719、0.679，均P<0.05)，与Ccr无明显相关性(r=0.512，P>0.05)。DN组AT1-AA阳性大鼠血清AT1-AA水平与细胞凋亡率呈显著正相关(r=0.733，P<0.01)。

表3 各组大鼠肾小管上皮细胞和肾小球足细胞凋亡率

注：与DN组AT1-AA阴性比较，1)P<0.01；与NC组比较，2)P<0.01

[本文图1、图2见封2、插2]

3 讨 论

肾素-血管紧张系统(Renin-Angiotensin System，RAS)是体内重要的内分泌系统之一，能有效维持血压稳定和水、电解质平衡。近20年的研究表明，除经典RAS外，肾脏组织中还存在局部RAS[12]。AngⅡ作为RAS的主要活性肽，在肾脏的基本生理效应主要是由AT1R介导。越来越多的研究证实，AngⅡ通过其靶分子AT1R激活多条信号通路，诱导炎症反应和细胞外基质合成，在DN进程中起重要作用[13]。

AT1-AA属于补体结合型IgG1和IgG3类抗体[4]，可与RAS关键因子AT1R的胞外第二环肽上的氨基酸序列相结合，发挥类似AngⅡ的激动效应，因其对AT1R的刺激作用不会出现脱敏现象而成为AngⅡ之外的另一条刺激AT1R的通路[14]。目前关于AT1-AA的产生主要涉及两方面的理论：一方面，各种组织损伤和生理紊乱导致隐蔽抗原暴露，机体自身免疫应答反应激活[15]，如AT1R上游分子AngⅡ浓度升高或胞内信号通路变化所致AT1R的构象和密度改变，均可导致机体AT1-AA产生增多[16-17]；另一方面，与AT1R抗原表位具有同源性的蛋白分子持续存在，则会通过分子模拟诱导AT1-AA产生[18]。

业已证实持续高血糖状态可使血管内皮细胞过度氧化，导致内皮细胞损伤，表面抗原暴露[19]，进而诱导自身免疫反应；而且肾脏局部RAS激活，系膜细胞合成AngⅡ增多，AngⅡ酶活性降低，局部AngⅡ水平升高[20]，均是DN状态下AT1-AA产生的主要机制。研究表明，AngⅡ可通过活化AT1R，激活炎症反应和氧化应激等多条信号通路，介导DN肾脏结构和功能损伤[21]，且AngⅡ拮抗剂能抑制内质网应激相关的肾脏细胞凋亡[22]。据此推测，具有AngⅡ样效应的AT1-AA也可能与DN时肾脏结构和功能改变及肾脏细胞凋亡有关，但对此研究，目前未见文献报道。

本研究中，DN组大鼠的BUN和24h UMA水平较NC组增加，Ccr降低，提示在该研究条件下，DN组大鼠肾脏功能明显减退。对比血清AT1-AA结果发现，DN组大鼠AT1-AA水平及阳性率均高于NC组，且AT1-AA阳性DN大鼠前述各项指标异常变化较AT1-AA阴性大鼠更明显；进一步相关分析显示，DN组大鼠血清AT1-AA与BUN、24h UMA水平均呈显著正相关，从而在实验动物体内证实AT1-AA与DN肾脏功能损害有关，且与作者前期的临床观察结果[23]一致。

为明确AT1-AA对肾脏结构改变和肾脏细胞凋亡的影响，本文分别观察了NC组和DN组AT1-AA阳性和阴性大鼠肾组织形态改变，超微结构变化及肾脏细胞凋亡的情况。光镜及透射电镜结果均显示，DN组AT1-AA阳性大鼠肾小管上皮细胞水肿、坏死，胞质溶解，肾小球基膜增厚，足突融合程度等均较AT1-AA阴性大鼠严重；NC组AT1-AA阳性大鼠偶见肾小管上皮细胞变性，而AT1-AA阴性大鼠的肾脏结构未见异常改变。细胞凋亡检测发现，DN组大鼠肾脏细胞总凋亡率显著高于NC组，且DN组AT1-AA阳性大鼠凋亡率明显大于AT1-AA阴性大鼠；相关分析结果也表明，AT1-AA与肾脏细胞凋亡显著正相关。上述结果均提示AT1-AA与DN大鼠肾脏细胞结构损害和凋亡关系密切。

已知正常人血清中常存在低效价的生理性自身抗体，主要起着清除自身衰老变性成分，维持机体内环境稳定的作用。但当机体AT1-AA生成增多，自身免疫反应激活，则可对肾脏产生病理性免疫损伤效应。本文NC组中AT1-AA阳性大鼠肾脏结构即出现了轻微损伤。DN状态下，随着血清AT1-AA水平升高，AT1-AA介导的自身免疫反应会持续存在，胞内信号转导通路相继激活，靶器官的损伤也会进行性加重，本文TUNEL检测结果即显示，DN组AT1-AA阳性大鼠肾脏细胞凋亡数量明显高于AT1-AA阴性大鼠。因此认为，血清AT1-AA可能与DN大鼠肾脏结构改变和肾脏细胞凋亡有关，但其致细胞凋亡的具体机制需进一步研究阐明。

综上所述，血清AT1-AA在DN大鼠肾脏功能损害中起重要作用，并与DN时肾小管上皮细胞和肾小球足细胞凋亡关系密切，可为临床中通过AT1-AA检测对糖尿病患者进行DN早期诊断和早期治疗提供理论依据。此外，由于血管紧张素转换酶抑制剂可以通过减弱自身免疫反应来降低血清AT1-AA水平[24]，因此可针对AT1-AA阳性DN患者进行个体化治疗，如给予AT1R拮抗剂或血管紧张素转换酶抑制剂，阻断AT1-AA的效应或降低AT1-AA水平来减轻肾脏损害，减少细胞凋亡，保护肾脏功能，起到预防和治疗DN的作用。

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本文第一作者简介：

徐春艳(1991-)，女，汉族，硕士研究生，研究方向为糖尿病及微血管并发症

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Relationship between Angiotensin ⅡType 1 Receptor Autoantibody and Kidney Damage and Renal Cells Apoptosis in Diabetic Nephropathy Rats

XU Chun-yan1，ZHAO Lin-shuang1,2,#

1Wuhan Clinical Medical School, South Medical University,Guangzhou 510515,China;2Department of Endocrinology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Command, Wuhan 430070, China;#

Objective: To explore the relationship between angiotensin Ⅱtype 1 receptor autoantibody (AT1-AA) and kidney tissue pathologic changes, and apoptosis of renal tubular epithelial cells and podocytesin diabetic nephropathy (DN) rats.Method: 36 SD rats were randomly divided into normal control group (NC,n=6) and DN model group (DN,n=30). DN model rats were induced by high-sucrose and high-fat diet and intraperitoneal injection of a small dose of streptozotocin (STZ, 35mg/kg). ELISA method was used to test the levels of serum AT1-AA, and respectively divided into AT1-AA positive and negative subgroups according to the ELISA results. The blood glucose (BG), renal function indicators and kidney hypertrophy index (KW/BW) were detected and calculated. HE staining and transmission electron microscope were applied to detect renal tubular and glomerulus pathological changes in all group rats. The apoptosis of renal tubular epithelial cells and podocytes were detected by TUNEL staining. Results: The level and positive rate of AT1-AA in DN group were significantly higher than that in NC group (P<0.01andP<0.05). When compared with NC group, the level of BG, rest of renal function indicators and the ratio of KW/BW in AT1-AA positive DN group were significantly increased, with the creatinine clearance rate (Ccr) decreased (allP<0.01). The levels of all the indicators above except BG in AT1-AA negative DN group were significantly reduced (P<0.05orP<0.01) compared with AT1-AA positive DN group.Comparing with NC group, the kidney and ultrastructure had pathological changes in AT1-AA positive DN group, the apoptosis rate of renal tubular epithelial cells and glomerular podocytes also increased significantly (P<0.01). While no obvious pathological changes were observed in the kidney of AT1-AA negative DN rats,and the cell apoptosis rate of AT1-AA negative DN group were obviously lower than that of AT1-AA positive DN group.Conclusion: These findings indicate that the AT1-AA levels may be related to the apoptosis of renal tubular epithelial cells and glomerular podocytes, and involved in the process of kidney damage.

Angiotensin Ⅱtype 1 receptor;Autoantibody;Cell apoptosis;Diabetic nephropathy

湖北省自然科学基金(2011CHC001)

1南方医科大学附属武汉临床学院，广州 510515；2广州军区武汉总医院内分泌科，武汉 430070；#

，E-mail:zls7111@aliyun.com

本文2014-10-20收到，2014-12-22修回

R587.2

A

1005-1740(2015)01-0004-06