阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌AmpC酶和ESBLs的检测及其耐药性研究

苏国娟，王国庆

(1.唐山市丰南区医院 检验科，河北 唐山063300；2.天津市口腔医院 检验科，天津300041)



阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌AmpC酶和ESBLs的检测及其耐药性研究

苏国娟1*，王国庆2

(1.唐山市丰南区医院 检验科，河北 唐山063300；2.天津市口腔医院 检验科，天津300041)

摘要：目的了解本地区阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌AmpC酶和ESBLs的流行分布及对临床常用抗菌药物的耐药情况，为临床合理用药提供依据。方法阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌的鉴定及药敏使用西门子MicroScan WALKAWAY96全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行，采用酶提取物三维试验方法检测AmpC酶，使用表型确证试验纸片扩散法测定ESBLs。结果76株阴沟肠杆菌中，产AmpC酶菌株为15株(19.74%)，产ESBLs菌株为24株(31.58%)，同时产两种酶的菌株为11株(14.47%)。43株奇异变形杆菌中，产AmpC酶菌株为7株(16.28%)，产ESBLs菌株为18株(41.86%)，同时产两种酶的菌株为6株(13.95%)。对其药敏结果分析显示产AmpC酶和ESBLs的菌株耐药性明显高于不产酶菌株。结论产AmpC酶和ESBLs是阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌产生耐药的重要机制，碳青霉烯类药物是治疗这两种细菌感染的首选药物。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0719)

阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌是环境中常见的肠杆菌科细菌，近年来已经成为重要的院内感染的病原菌。随着三、四代头孢菌素的大量广泛使用，这两种细菌的耐药性不断增加，其中产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)是最主要的耐药机制，给临床抗感染治疗带来很大困难。本研究通过检测本地区临床分离的阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌产AmpC酶和ESBLs情况并对其耐药情况进行分析，为正确掌握细菌耐药的发展趋势、临床合理使用抗菌药物及延缓和控制细菌耐药基因的播散提供理论依据。

1材料与方法

1.1菌株来源菌株为2013年唐山市工人医院和丰南区医院临床标本中分离鉴定的76株阴沟肠杆菌和43株奇异变形杆菌，同一患者无重复菌株。阴沟肠杆菌029 M作为产AmpC酶阳性对照质控菌株、肺炎克雷伯菌ATCC 700603作为产ESBLs阳性对照质控菌株、大肠埃希菌ATCC 25922作为不产AmpC酶和ESBLs两种酶的阴性对照质控菌株。

1.2培养基、药敏纸片及试剂血平板、MAC平板、M-H琼脂平板、胰大豆蛋白胨为天津金章公司生产。头孢他啶(CAZ，30 μg)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA，30/10 μg)、头孢噻肟(CTX，30 μg)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA，30/10 μg)药敏纸片为Oxoid公司生产。

1.3鉴定和药敏菌株鉴定及药敏试验使用MicroScan WALKAWAY 96全自动细菌鉴定及药敏分析系统。

1.4AmpC酶的检测采用酶提取物三维试验方法检测AmpC酶。按Coudron PE等[1]方法并加以改进。将疑产AmpC酶的菌株转种到胰酶大豆消化液中，然后把对数生长期的细菌培养物离心，取沉淀部分反复冻融(-70℃及37℃水浴交替) 5次制备酶的粗提物。将30 μg的头孢西丁纸片放置在均匀涂布0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922的M-H琼脂平板中央，使用无菌刀片在距头孢西丁纸片边沿5 mm处开始向外呈放射状地挖一约20 mm×2 mm的狭缝，将待测菌株的酶粗提物加入细槽中，置35℃孵育箱培养过夜。若在狭缝与头孢西丁的抑菌环之间出现扩大的长菌区域，即为AmpC酶阳性。

1.5ESBLs的检测依据CLSI 推荐的表型确证试验纸片扩散法测定ESBLs。采用头孢他啶(30 μg)及头孢他啶/克拉维酸(30/10 μg)组合、头孢噻肟(30 μg)及头孢噻肟/克拉维酸(30/10 μg)组合。头孢他啶和头孢噻肟2个药物中任何一个，在加克拉维酸后，抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比，增大值≥5 mm,判定为产ESBLs阳性。肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大肠埃希菌ATCC 25922分别作为ESBLs检测的阳性和阴性质控对照菌株。

2结果

2.1AmpC酶和ESBLs检出率76株阴沟肠杆菌中，产AmpC酶菌株为15株(19.74%)，产ESBLs菌株为24株(31.58%)，同时产两种酶的菌株为11株(14.47%)，均不产两种酶的菌株为26株(34.21%)。43株奇异变形杆菌中，产AmpC酶菌株为7株(16.28%)，产ESBLs菌株为18株(41.86%)，同时产两种酶的菌株为6株(13.95%)，均不产两种酶的菌株为12株(27.91%)。

2.276株阴沟肠杆菌对14种抗菌药物耐药率见表1。

表1　76株阴沟肠杆菌对14种抗菌药物耐药率情况(%)

2.343株奇异变形杆菌对14种抗菌药物耐药率见表2。

3讨论

阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌广泛存在于自然环境中，是人体的正常菌群，也是很常见的条件致病菌，随着侵入性诊断及治疗操作的增加，其已经成为医院感染的重要病原菌，因此，分析其产酶及耐药情况对有效控制感染、合理使用抗菌药物及有效控制细菌耐药基因的播散具有重要意义。阴沟肠杆菌以及奇异变形杆菌耐药情况严重，给临床治疗治疗带来很大困难，而产AmpC 酶和产ESBLs是其对β-内酰胺类抗菌药物耐药的两个主要机制。

表2　43株奇异变形杆菌对14种抗菌药物耐药率情况(%)

ESBLs属Bush分类中的2 be类酶，ESBLs的产生，可使细菌对青霉素类、头孢菌素和氨曲南在内的大多数β-内酰胺类抗菌药物耐药，但对头霉素、碳青霉烯类及酶抑制剂复方制剂敏感[2]。本研究显示，76株阴沟肠杆菌中，产ESBLs菌株为24株(31.58%)，高于其他地区[3-6]。43株奇异变形杆菌中，产ESBLs菌株为18株(41.86%)，高于石兰峰、徐传和、朱巧玲、彭健新、卢雪明等[6-10]的报道及全国平均水平[2]，但低于周强等[5]的报道。此外，本研究中产ESBLs菌株对多种抗菌药物的耐药率，显著高于非产ESBLs菌株。这可能与其易于在菌属间传递的质粒介导耐药决定簇有关，由于携带编码ESBLs质粒的菌株，往往同时携带氨基糖苷类等抗菌药物的耐药基因，从而使产ESBLs菌株，呈现多重耐药[11，12]。

AmpC酶又称头孢菌素酶，是染色体或质粒介导的β-内酰胺酶，属于分子分类法的C类和功能分类法的Ⅰ组酶，具有比产ESBLs更广的水解底物谱，因其具有较快的传播速度和较强的耐药性，故耐药情况更为复杂[13]，但其可被四代头孢、碳青霉烯类抑制。AmpC酶可以水解青霉素类抗菌药物、第1-3代头孢菌素类、头霉素类和单环酰胺类，且不受克拉维酸、舒巴坦等酶抑制剂的抑制，这为临床感染治疗提出很大难题[2]。本研究显示，76株阴沟肠杆菌中，产AmpC酶菌株为15株(19.74%)，高于陆丹倩等[3]的报道，低于周强、彭健新、赵德军等[4-6]的报道。43株奇异变形杆菌中，产AmpC酶菌株为7株(16.28%)，高于石兰峰、徐传和、朱巧玲、彭健新、卢雪明等[6-10]的报道。AmpC酶菌株通常同时携带有其他种类抗菌药物的耐药基因，包括氨基糖甙类、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类以及四环素等药物的耐药基因，故而表现为对青霉素类、第1-3代头孢菌素、头霉素类、单环类及酶抑制剂(如舒巴坦、克拉维酸、三唑巴坦)复合物均耐药，其往往还对氨基甙类、磺胺类、氯霉素类和四环素类等抗菌药物耐药[14]。

总之，阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌常常呈现多重耐药，给临床治疗治疗带来了极大的困难。及时、准确的针对可能的医院感染病原菌进行检测及监测其耐药性变化，并根据药敏结果合理使用抗菌药物，同时加强消毒隔离措施以减少交叉感染，这样能够有效控制医院感染、预防耐药菌的产生及传播。

参考文献：

[1]Coudron PE,Moland ES,Thomson KS.Occurrence and detection of AmpC beta-lactamases among Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center[J].J Clin Microbiol,2000,38(5):1791.

[2]吕媛，郑波，李耘，等.Mohnarin 2009年度报告:肠杆菌科细菌耐药监测[J].中国临床药理学杂志，2011，27(5)：340.

[3]陆丹倩，顾向明，邓冲，等.阴沟肠杆菌高产AmpC酶和ESBLs的检测及其多重耐药研究[J].国际检验医学杂志，2013，34(7)：870.

[4]赵德军，胡昭宇，武静，等.产ESBLs及AmpC酶阴沟肠杆菌的检测及耐药性分析[J].国际检验医学杂志，2011，32(10)：1118.

[5]周强，张文，邓晨晖.某地区分离自呼吸系统感染患者产ESBLs、AmpC酶肠杆菌科细菌耐药性检测[J].国际检验医学杂志，2012,33(5)：552.

[6]彭健新.肠杆菌科细菌产AmpC酶和ESBLs的状况及对β-内酰胺类药物药敏检测分析[J].吉林医学，2011，32(18)：3684.

[7]石兰峰，钮博.奇异变形杆菌ESBL和AmpC酶的检测与耐药分析[J].中国厂矿医学，2009，22(1)：75.

[8]徐传和，朱洪权，郑连荣，等.奇异变形杆菌培养及其药敏结果分析[J].中国实验诊断学，2008，12(12)：1566.

[9]朱巧玲.奇异变形杆菌对常用抗生素的耐药分析[J].成都医学院学报，2009，4(4)：277.

[10]卢雪明，曾翠兰.62株奇异变形杆菌的耐药性分析[J].青岛医药卫生，2010，42(1)：7.

[11]Pfeifer Y，Cullik A，Witte W．Resistance to cephalosporins and carbapenems in Gram-negative bacterial pathogens[J]．Int J Med Microbiol，2010，300：17.

[12]Yang Q,Wang H,Sun H,et al.Phenotypic and genotypic characterization of Enterobacteriaceae with decreased susceptibility to carbapenems:results from large hospital-based surveillance studies in China[J]．Antimicrob Agents Chemother,2010,54:573.

[13]龚强.质粒介导AmpC酶的分类、检测与抑制策略[J].西南军医，2012，14(2)：314.

[14]李智伟,向阳,赵辉,等.1175株阴沟肠杆菌耐药性变迁特点[J].新疆医科大学学报，2012，35(10)：1379.

关键词：阴沟肠杆菌；奇异变形杆菌；AmpC酶；ESBLs；耐药性

Detection of ESBLs and AmpC β-lactamase producingEnterobactercloacaeandProteusmirabilisand analysis of drug resistanceSUGuo-juan,WANGGuo-qing.(FengnanPeople＇sHospitalofTangshan,Tangshan063300,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the production of AmpC enzyme and ESBLs in Gram-negative bacilli and their drug-resistance to provide basis for reasonable use of antibiotics in clinical practice.MethodsIdentification and drug susceptibility ofEnterobactercloacaeandProteusmirabiliswere performed by Siemens MicroScan WALKAWAY 96.AmpC and ESBLs were determined by three dimensional test and a phenotypic confirmatory test respectively.ResultsAmong 76Enterobactercloacaestrains,15(19.74%) of them were detected to produce AmpC β-lactamase,24(31.58%) of them were detected to produce ESBLs,11 (14.47%) of them were detected to produce AmpC β-lactamase and ESBLs.Among 43Proteusmirabilisstrains,7(16.28%) of them were detected to produce AmpC β-lactamase,18(41.86%) of them were detected to produce ESBLs,6 (13.95%) of them were detected to produce AmpC β-lactamase and ESBLs.The drug susceptibility testing result indicated that the drug resistance rate of enzyme-producing strains was higher than that of the non-enzyme-producing strains.ConclusionAmpC β-lactamase and ESBLs have been a critical cause of the drug-resistance inEnterobactercloacaeandProteusmirabilis.Carbapenems can be the first choice to treatEnterobactercloacaeandProteusmirabilisinfections.

Key words:Enterobactercloacael;Proteusmirabilis;AmpC β-lactamase;ESBLs;Drug resistance

(收稿日期：2014-10-11)

作者简介：苏国娟(1973-)，女，副主任技师，主要研究方向为临床微生物学。

文献标识码：A

中图分类号：R378.2

文章编号：1007-4287(2015)05-0719-04

*通讯作者

基金项目：天津市卫生局科技基金(2013ky23)