PCR－焦磷酸测序法快速鉴定食品中肠炎沙门菌

曹 冬 梅，倪 长 鹏，刘 宇，卢 熠 川，许 龙 岩，曹 际 娟

（1.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001；2.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；3.广东出入境检验检疫局，广东 广州 510623）

0 引 言

沙门菌属菌型甚多，目前在全世界范围内已发现2 500余种血清型，我国也有292种被检出的报道［1］。肠炎沙门菌（SalmonellaEnteritidis，SE）是肠道沙门菌的一种主要血清型，由于其致病性强、感染对象广泛等特点，引起了各国学者的广泛关注［2－5］。1996年，我国向欧洲出口的兔肉中检测出了肠炎沙氏菌，直接导致损失3 000多万元［2］。2010年，美国加利福尼亚州肠炎沙门菌疫情肆虐，染病人数多达数百人，引发疫情的“问题蛋”召回数量达到5亿枚，造成了严重的经济损失。目前，肠炎沙门菌最主要检测手段仍是生化鉴定配合血清分型，但检测周期过长，不利于疾控预防与病情诊断。荣策等［6］建立Taqman探针实时荧光PCR 检测食品中肠炎沙氏菌的方法。田会方等［7］采用PCR－焦磷酸测序技术在沙门菌食物中毒中进行了应用检测，但不能鉴定血清型。

焦磷酸测序（pyrosequencing）是一种新的序列分析技术，其特点是操作简便、大通量、自动化，适合大量样本的快速检测，无须进行电泳、序列无须荧光标记等，是一个理想的遗传分析技术平台［8－9］。因而广泛应用于基因表达［10］、病毒检测［11］、SNP分析［12］等多个领域。本研究基于PCR－焦磷酸测序技术，建立快速检测肠炎沙门菌的方法加以应用。对于方法的特异性、准确性以及与传统鉴定相符性进行分析，旨在所建立的方法能在食物中毒快速诊断和食品安全领域快速鉴定肠炎沙门菌中得以应用。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

肠炎沙门菌标准菌株1 株，临床分离株13株。阴性对照菌株为鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等8 株标准菌株，以及22株其他血清型的沙门菌分离株（本实验室留存），所有菌株信息见表1。所有菌株均经过VITEK2、API试剂条和血清学鉴定。

1.1.2 主要仪器和试剂

PCR 扩增仪（PE 9700）；定量遗传分析系统，Biotage Company；核酸提取仪，Precision System Science（Japan）；PCR 混合缓冲剂、Taq DNA 聚合酶、MgCl2、100bp DNA Marker、琼脂糖，宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖珠，GE Healthcare（UK）；酶、dNTP、结合缓冲液、退火缓冲液、变性缓冲液、洗涤缓冲液，QIAGEN（中国）；缓冲蛋白胨水（BPW）、连四硫酸盐肉汤（TTB），北京陆桥公司。

表1 菌株信息表Tab.1 The list of strains

1.2 方 法

1.2.1 引物设计

根据 GenBank 公布的肠炎沙门菌（AF370707.1）序列的保守区域，采用PyroMark Assay Design 2.0设计扩增引物与测序引物（表2），扩增片段大小为176bp。在反向引物5′端标记生物素。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表2 肠炎沙门菌PCR 扩增引物和测序引物Tab.2 The amplification primers and sequencing primers of Salmonella Enteritidis

1.2.2 模板制备

沙门菌菌株于BPW 37 ℃培养10 h，取10mL接种于TTB增菌液，44.5 ℃培养18h，取1mL菌悬液移入离心管，12 000r／min离 心5min去上清，用1 mL 去离子水漂浮沉淀，12 000r／min离心3min去上清，重复2次，最后加200μL去离子水，在核酸提取仪上提取DNA，用于PCR 扩增。

1.2.3 PCR 扩 增

扩增体系为50μL，混合缓冲剂25μL，Taq DNA 聚合酶5μL，MgCl21μL，SEF／SER 引物（10μmol／L）各2μL，模板1μL，去离子水14μL。循环参数为预变性95 ℃5min、95 ℃15s、65 ℃30s、72 ℃30s，45个循环，72 ℃12min，4 ℃保存。PCR 产物一部分进行2%琼脂糖凝胶电泳，另一部分用于焦磷酸测序。

1.2.4 单链模板制备及焦磷酸测序

将15μL 的PCR 产物转移至96孔PCR 板中，加入2μL 琼脂糖珠，20μL 结合缓冲液和43μL纯水，常温振荡混合20 min；打开真空泵，利用高纯水清洗准备工具30s并转移至96 孔板，用于抓取琼脂糖珠；完毕后将携有琼脂糖珠的准备工具放入70%乙醇中5s，再分别在变性缓冲液和洗涤液中各清洗20～30s；准备工具放在装有退火预混液PSQ 96 板上（预先加入43μL退火缓冲液和2μL测序引物），关掉真空泵，轻轻摇动并释放磁珠；在80 ℃将PSQ 96 板保温5min，自然冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。测序程序采用SQA 模式，按ATCG 的碱基排列顺序，依次循环加入15次，根据软件给出的剂量在试剂仓中加入底物混合物、酶混合物和4种脱氧核糖核苷酸，将PSQ 96孔板和试剂仓放入定量遗传分析系统中进行焦磷酸测序。测序峰及相应的DNA 碱基序列由仪器SQA 软件自动分析产生。

1.2.5 与传统生化鉴定方法的比对验证

分别称取25g猪肉和虾（无沙门菌污染）为基质样品，每份样品中加入225 mL 缓冲蛋白胨水，接种肠炎沙门菌 ATCC13076 菌悬液（102cfu／mL），制备2 份模拟样品。用拍打器拍打20min，37 ℃培养10h。分别取10mL 增菌液移入90 mL TTB 增菌液，44.5 ℃培养18h。然后，取一部分提取DNA 进行PCR－焦磷酸测序，另一部分按照GB 4789.4—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门菌检验》进行验证检验。同时，对日常进出口的食品样品也采用上述两种方法检测肠炎沙门菌，并进行比对验证。

2 结果与分析

2.1 PCR 特异性扩增结果

采用SEF／SER 引物进行PCR 扩增和电泳检测，结果如图1 所示。肠炎沙门菌标准菌株ATCC14028及15株分离株（SE1～SE15）均扩增出176 bp 的DNA 片段；而鼠伤寒沙门菌ATCC14028、22株其他血清型沙门菌以及大肠埃希氏菌等阴性对照菌株均未见扩增条带。结果表明，本实验设计的肠炎沙门菌PCR 扩增引物具有较好的特异性。

图1 PCR 特异性扩增肠炎沙门菌的电泳图Fig.1 PCR result of Salmonella Enteritidis

2.2 焦磷酸测序结果

对PCR 扩增产物进行焦磷酸测序，结果如表3和图2 所示。14 株肠炎沙门菌（SE1～SE13、SE ATCC14028）分别测出39～43nt的DNA 序列。将这些序列进行BLAST 比对，发现与Genbank中肠炎沙门菌的核苷酸序列呈100%匹配。其他菌株未出现PCR 扩增产物的电泳条带，因而均无测序结果。结果表明，焦磷酸测序法可以对肠炎沙门菌进行准确鉴定。

表3 14株肠炎沙门菌的焦磷酸测序结果Tab.3 Pyrosequencing results of 14 Salmonella Enteritidis strains

图2 肠炎沙门菌ATCC13076 的焦磷酸测序图谱Fig.2 Pyrosequencing map of Salmonella Enteritidis ATCC13076

2.3 比对验证结果

对2份模拟样品进行PCR－焦磷酸测序检测，均检测出与预期相符的肠炎沙门菌的DNA碱基序列，即CCTGTTGTCT GCTCACCATT CGCCAGCCAC。同时，将模拟样品按照GB 4789.4—2010进行检测，均分离鉴定出与添加菌株相一致的肠炎沙门菌。

采用本方法共检测了360份实际进出口食品样品，在冻鸡和鸡屁股2份样品中检测出肠炎沙门菌阳性。同时，此样品也采用经典的培养和生化鉴定方法进行检测，结果符合率为100%。结果表明，本实验建立的焦磷酸测序方法与传统生化鉴定检测的结果相一致，应用PCR－焦磷酸测序方法检测肠炎沙门菌具有较好的应用效果。

3 讨 论

国内外针对食源性致病菌的快速检测技术进行了广泛的研究，研究较多的快速检测技术是基于实时荧光PCR 方法［13－14］，该方法简便、实用，但存在着假阳性的可能性。近几年发展了更为快速的MALDI－TOF－MS检测技术［15］，该方法鉴定准确，但需要建立在量数据库的基础上才能实现鉴定。也有报道采用细菌16SrDNA 基因文库的构建和分析技术［16］，探讨细菌的多样性的研究。由此可见，各种检测技术都有不同的优势和不足。

焦磷酸测序是一种非常具有潜力的DNA 测序技术，有着广阔的应用领域。在短片段测序的应用中，可能会代替Sanger 末端终止法［17］。2005年，Balitzki－Korte等［18］利用焦磷酸测序技术对人、牛、羊、鸡等动物的线粒体12SrRNA 基因进行了检测。同年，Allen M 等［19］利用焦磷酸测序技术对mtDNA 进行了检测，验证了该技术准确、灵敏度好。国内在此方面也有深入的研究。卢熠川等［20］利用焦磷酸测序方法检测食品中肠道沙门氏菌，但只是停留在种的水平上。曹冬梅等［21］利用焦磷酸测序技术检测食品中鼠伤寒沙门氏菌，解决了沙门菌种以下水平的血清型的鉴定问题。

本实验根据肠炎沙门菌的特异序列，分别设计扩增引物和测序引物，建立了PCR－焦磷酸测序快速鉴定肠炎沙门菌的方法。通过模拟样品和实际样品的检测，证明了PCR－焦磷酸测序快速鉴定方法与传统检测方法的一致性。与传统的鉴定方法相比，PCR－焦磷酸测序法缩短了检测时间，整个实验可以在31h 内完成。此外，PCR－焦磷酸测序法可以获得DNA 碱基序列，准确性更高，在食品安全快速鉴定、食物中毒快速诊断及医学生物等领域拥有着很好的应用前景。

［1］张燕，朱超.我国沙门氏菌病和菌型分布概况［J］.现代预防医学，2002，29（3）：400－401.

［2］张艳红，杜元钊，吴延功.肠炎沙门氏菌快速检测方法的建立［J］.中国动物检疫，2002，19（7）：25－28.

［3］ERKMEN O，BARAZI A.Survival probability ofS.typhimuriumin suck［J］.Fleischwirtschaft，2008，88（7）：98－103.

［4］TAMAGNINIA L M，SOUSAA G B，GONZáLEZA R D，et al.Behavior ofYersiniaenterocoliticaandSalmonellatyphimuriumin Crottin goat’s cheese［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，99（2）：129－134.

［5］MITTRÜCKER H W，KAUFMANN S H.Immune response to infection withSalmonellatyphimuriumin mice［J］.Journal of Leukocyte Biology，2000，67（4）：457－463.

［6］荣策，孙铭英，那晗，等.建立Taqman探针实时荧光PCR 检测食品中肠炎沙门氏菌的方法［J］.中国卫生产业，2012（9）：7－11.

［7］田会芳，徐保红，李秀娟，等.PCR－焦磷酸测序技术在沙门菌食物中毒中的应用［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（11）：2584－2585.

［8］翟仙敦，刘之江，侯一平.焦磷酸测序技术及其法医学应用［J］.中国司法鉴定，2009（4）：39－42.

［9］汤华阳，杜卫东，张学军.焦磷酸测序技术及应用［J］.医学分子生物学杂志，2007，4（3）：272－275.

［10］ZHANG Xiao－dan，WU Hai－ping，CHEN Zhi－yao，et al.Differential gene expression analysis by combining sequence－tagged reverse－transcription polymerase chain reaction with pyrosequencing［J］.Chinese Journal of Chemistry，2009，37（8）：1107－1112.

［11］WANG Wei－peng，WU Hai－ping，ZHOU Guo－hua.Detection of avian influenza a virus using pyrosequencing［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2008，36（6）：775－780.

［12］BENDER K，NEHLICH C，HARRISON，C，et al.A multiplex SNP typing approach for the DNA pyrosequencing technology［J］.International Congress Series，2006，1288：73－75.

［13］刘冉，赵玉琢，孙铭英，等.建立实时荧光PCR 快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法［J］.辽宁师范大学学报，2014，37（2）：252－257.

［14］郑秋月，赵彤彤，袁慕云，等.实时荧光PCR 检测食品中丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌［J］.食品科技，2014，39（2）：297－301.

［15］王耀，曹际娟，赵昕，等.单增李斯特氏菌MALDITOF－MS鉴定与分型研究［J］.食品科学，2012，33（3）：194－198.

［16］高美玲，张公亮，侯红漫.大连海湾仿刺参肠道细菌多样性的16SrDNA 分析［J］.大连工业大学学报，2014，33（2）：84－89.（GAO Meiling，ZHANG Gongliang，HOU Hongman.Bacterial diversity in the intestine ofApostichopusjaponicusin Dalian Bay［J］.Journal of Dalian Polytechnic University，2014，33（2）：84－89.）

［17］RONAGHI M.Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing［J］.Genome Research，2001，11（1）：3－11.

［18］BALITZKI－KORTE B，ANSLINGER K，BARTSCH C，et al.Species identification by means of pyrosequencing the mitochondrial 12SrRNA gene［J］.International Journal of Legal Medicine，2005，119（5）：291－294.

［19］ALLEN M，ANDRÉASSON H.Mitochondrial Dloop and coding sequence analysis using pyrosequencing［M］／／Forensic DNA Typing Protocols.New York：Humana Press，2005：179－195.

［20］卢熠川，徐杨，刘宇，等.焦磷酸测序方法检测食品中肠道沙门氏菌［J］.中国公共卫生杂志，2014，30（6）：145－148.

［21］曹冬梅，徐杨，袁慕云，等.焦磷酸测序检测食品中鼠伤寒沙门氏菌［J］.微生物学杂志，2013，33（6）：101－105.